[发明专利]培养吸水链霉菌生产雷帕霉素发酵液的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种微生物发酵生产雷帕霉素的方法。

背景技术

雷帕霉素(Rapamycin，RPM，RAPA)，又名西罗莫司(Sirolimus)，是在1975年由加拿大Ayerst研究所从吸水链霉菌(Strepomyces hygroscopicus)中分离出来的三烯大环内酯类抗生素，它作为一种新型的高效免疫抑制剂引起了广泛的关注，同时它又是一种有效的抗真菌剂并具有抗肿瘤的作用。

雷帕霉素是31元环组成的三烯大环内酯化合物，含有特殊的α、β-二酮乙哌啶酸胺分子掩盖的半羧酮，其分子式为C₅₁H₇₉O₁₃，分子量为991。雷帕霉素是一类亲酯类抗生素，外观通常为白色结晶体。易溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂，几乎不溶于乙醚、己烷、石油醚，极微溶于水。在血浆中pH呈低中性，37℃时降解特别快，在血浆中半衰期为1～5h，在甲醇中不稳定。其熔点为183～185℃，比旋光度[α]D25＝153°(甲醇)。Vezinia等于1975年发现它具有抗真菌作用，以后Tanaka等又发现它是一种极有前途的免疫抑制剂并具有抗肿瘤作用。同时西罗莫司具有很强的抗移植排斥反应，并能与环孢素协同延长移植物存活时间，西罗莫司还能逆转正在进行的移植排斥反应。另外，西罗莫司还有预防和治疗实验性自身溶血性贫血的作用。

雷帕霉素在防止动物器官移植排斥作用的效果大大强于现行临床广泛应用的环孢霉素A(cyclosporin A，CsA)，也胜于大环内酯类同类药物FK506(他克莫司)，是临床上很有潜力的免疫抑制剂。由于RPM和CsA的化学结构不同，与FK506既相似，又有差异，RPM与CsA、FK506等联用均有良好的协同作用，联用的益处在于：减少了治疗方案中各种免疫抑制剂的用量；减少了免疫抑制剂的副作用；增强了免疫抑制剂效果。雷帕霉素的作用机制和CsA及FK506均不同。CsA和FK506分别与细胞浆内环孢亲和素和FKBP12(FK506结合蛋白)相结合，抑制Calcineurin(钙调磷酸酶)，阻止细胞因子如白介素-2(IL-2)的表达和转录，抑制T细胞活化的早期阶段。RPM与FK506具有相似的分子结构，也能与FKBP12结合，RAPA-FKBP12复合物与哺乳类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)结合，但它不阻断T细胞生长因子的生成，而是阻断这些因子提供的增生信号，抑制多种刺激引起的T和B淋巴细胞的增生，是细胞停留在细胞周期G1期的晚期，阻止这些细胞进入S期。综上所述，雷帕霉素作为一种高效新型的免疫抑制剂，它在临床器官移植及治疗自身免疫疾病中具有重要的意义。

1993年，美国Merck公司通过微生物转化的方法转化为雷帕霉素，前期种子液培养后，发酵液最终产生了300mg/L的雷帕霉素。印度科学家从土壤中筛选了高产雷帕霉素链霉菌，且副产物极少，在高通气量的糊精培养基中通过补料分批发酵产生了300～310mg/L的雷帕霉素。2004年，印度学者Vaid等对一株链霉菌进行诱变，将植物油作为惟一碳源进行发酵，结果表明连续发酵144～192h，雷帕霉素的产率可达到180～330mg/L。1999年10月20日雷帕霉素在美国上市，为口服液剂型。此后采用伊兰(Elan)公司的纳米晶体技术制备的1mg片剂也已在美国上市。2000年3月雷帕霉素在英国、德国、丹麦等国上市，此外雷帕霉素还在英国以口服混悬剂的方式销售。

由于美国生产的雷帕霉素在我国未能获得行政保护，故国内企业可以生产雷帕霉素。据了解，自2001年至今，国家食品药品监督管理局已先后批准了7家企业生产雷帕霉素，其中浙江新昌制药厂、福建科瑞药业、杭州中美华东制药、华北制药科研开发公司4家为雷帕霉素原料药厂。目前，有文献报导的发酵水平均不高，最高产量在600mg/L-700mg/L。

杭州中美华东医药股份有限公司已经投入工业化生产(中国专利CN200810019207.8)，在10吨、50吨发酵罐上培养吸水链霉菌发酵能力在600mg/L左右。张薇等在《雷帕菌素高产菌株的推理选育与发酵新工艺研究》(2009年浙江大学硕士学位论文)一文中公开了菌种选育和培养条件优化，在20吨发酵罐中发酵能力为700mg/L。

由此可知，目前雷帕霉素生物发酵生产存在的不足在于雷帕霉素生物发酵单位不高，不利于提取纯化，不能充分满足工业化生产的要求。

发明内容