[发明专利]一种β-脱卤酶的基因及制备3-羟基丙酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备3-羟基丙酸的方法，特别涉及一种利用生物转化法生产3-羟基丙酸的方法。

背景技术

3-羟基丙酸(简称3-HP)是一个三碳无手性直链有机酸，分子量90.08。它是一种无色无味的油状液体，可与水、醇、醚等多种有机溶剂互溶。3-羟基丙酸与乳酸互为同分异构体，该分子两端分别带有一个羟基和一个羧基，化学性质较为活泼，工业上作为一种重要的化学中间体，可以用来合成很多重要的化工产品，如脱水生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，与醇通过酯化作用生成酯，还可通过还原作用生成1，3-丙二醇等。3-羟基丙酸还可用于生产涂料、交联剂、水处理化学品和个人护理用品等。另外，由于3-羟基丙酸具有良好的生物可降解性和生物相容性，其聚合物可被应用于生产药物缓释材料以及作为手术缝合材料等。聚3-羟基丙酸可以替代许多化学基聚合材料，具有很大的应用潜力。基于3-羟基丙酸的这些优良性质及其在商业上的重大开发价值，2004年美国能源部报告将3-羟基丙酸列为当前世界上12种最具开发潜力的平台化工产品之一。

传统的3-羟基丙酸生产方法主要是化学合成法，如1，3-丙二醇氧化法，利用丙烯酸合成3-羟基丙酸等方法。由于化学反应中，很难在三碳化合物的一端引入功能基团，所以利用这些化学合成法生产3-羟基丙酸具有设备投资大、技术难度高、需要重金属催化污染环境等缺点，且生产过程中能耗高、收率低、副产物多、产品分离纯化较复杂，也致使产品生产成本相应较高。并且化学合成需要利用不可再生的石油资源为原料，这些都限制了3-羟基丙酸衍生产品及其聚合物的应用。

3-羟基丙酸的生物转化方法主要有两条途径。一条是由美国Gargill公司构建的，以葡萄糖为底物发酵生产3-羟基丙酸的转化路线。该路线由存在于丙酸梭菌体内的β-丙氨酸代谢路径和橙色绿曲挠菌的3-羟基丙酸循环路径组合而成。将3-羟基丙酰CoA脱水酶(OS19)基因和乳酰CoA脱水酶(LCD)基因克隆进大肠杆菌体内，得到了可以利用葡萄糖生产3-羟基丙酸的重组菌。目前该路径生产3-羟基丙酸的产量可达到25g/L以上。另一条是以甘油为底物生产3-羟基丙酸，路线涉及到甘油脱水酶和乙醛脱氢酶。甘油先通过甘油脱水酶的作用转化成3-羟基丙醛(3-HPA)，然后3-羟基丙醛在乙醛脱氢酶的作用下转化成为3-羟基丙酸。该工程菌产量仅为170mg/L。后由日本学者将这种构建思想进行了改进，在该途径中加入了1，3-丙二酸的代谢支路，并用二醇脱水酶代替了甘油脱水酶，用丙烯醛脱氢酶、磷酸转乙酰酶和丙酸激酶代替了醛脱氢酶，以1mol/L甘油为底物，3-羟基丙酸的产率达到了40％。但是由于发酵法生产3-羟基丙酸副产物多，分离纯化困难，目前还很难应用于大规模的工业生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的制备3-羟基丙酸的方法。

为实现上述目的，本发明首次构建了能表达β-脱卤酶的重组细胞。

具体地说，本发明所采取的技术方案是：

本发明的β-脱卤酶的基因具有如SEQ No.1所示序列。

本发明的芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.4196，含有具有如SEQ No.1所示序列的基因。

本发明的β-脱卤酶由具有如SEQ No.1所示序列的基因所编码。

本发明制备3-羟基丙酸的方法是包括以下步骤：

(1)将所述芽孢杆菌的具有如SEQ No.1所示序列的基因通过质粒导入宿主细胞，得到重组细胞；

(2)将所述重组细胞加入到离子缓冲溶液中破胞，离心得到上清液，将所述上清液经镍离子亲和层析柱和脱盐柱纯化得到纯酶液；

(3)将3-氯丙酸溶液加入到所述纯酶液中进行反应得到3-羟基丙酸，所述3-氯丙酸相对于3-氯丙酸溶液和纯酶液总量的摩尔浓度为10～50mmol/L。

进一步地，本发明步骤(3)中所述反应的温度为20～50℃。

进一步地，本发明所述宿主细胞为大肠杆菌。

进一步地，本发明所述离子缓冲溶液的摩尔浓度为100mmol/L、pH为4～10。

本发明方法相对于传统的化学合成方法和微生物发酵法具有以下优点：