[发明专利]一种基于脱氧核酸酶的铅离子检测芯片、制作及使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于脱氧核酸酶(DNAZyme)的铅离子检测芯片制作及其应用方法，属于生物分析技术领域。

背景技术

由于铅在燃料、建筑材料、涂料、油漆及工业加工中的广泛应用，所以铅在环境包括土壤、水、甚至食物链中普遍存在。铅的污染向来是一个很严重的环境问题。以铅离子为代表的无机污染物一旦进入环境后，不会像有机污染物那样在环境中被快速分解，它们可能长期残留于环境中，产生经久不衰的污染。而进入人体的铅离子对人体的健康也存在着巨大危害，当人体内铅含量超过一定水平时，将严重影响人们的身体健康，特别是儿童的健康。铅中毒至少损害到三种人体器官：(1)周围及中枢神经系统；(2)亚铁血红细胞的生物合成途径；(3)肾脏功能。

如何有效地进行环境中铅离子含量的测定，成为摆在广大分析工作者面前的一个问题。目前传统的铅检测技术：原子吸收光谱、高效液相色谱、毛细管电泳、双硫腙比色法、X射线荧光技术、中子活化分析或电感耦合等离子体质谱分析法等，尽管能够得到比较精确的检测结果，但这些技术往往要依赖大型仪器设备、耗费耗时、需进行样品预处理，需要专门的技术人员进行操作，检测成本高，很难满足产地现场快速检测的要求，并且其中有些方法还需要用到有毒试剂，难以被分析人员接受。因此，在很多重要的场合，人们迫切需要简便、快速、经济、准确的分析检测铅离子的方法。目前，国内外对铅离子进行现场检测的方法在灵敏度和专一性上不能够满足要求。

脱氧核酸酶(DNAzyme)是通过体外筛选技术(SELEX技术)得到的具有酶活性的小分子单链DNA，其催化的反应范围很广：DNA或RNA的剪切反应、DNA的连接反应、磷酸化反应等。一些脱氧核酸酶的活性与特定二价金属离子辅因子密切相关。由于DNAzyme具有易于合成和修饰、稳定性好及对环境污染小等特点，使其在金属离子检测中的应用备受关注，其中较为典型的是Lu等人发现的对Pb²⁺特异的8-17E DNAzyme(Brown，A.K.；Li，J.；Pavot，C.M.B.；Lu，Y.Biochemtstry 2003，42，7152-7161.)，并由此发展了各种基于8-17E DNAzyme检测Pb²⁺的方法：如均相荧光法(Li，J.；Lu，Y.J.Am.Chem.Soc.2000，122，10466-10467)、纳米金聚集比色法(Liu，J.W.；Lu，Y.J.Am.Chem.Soc.2003，125，6642-6643)，在金表面上组装8-17E DNAzym进行液相荧光检测的方法(Swearingen，C.B.；Wernette，D.P.；et al.Anal.Chem.2005，77(2)，442-448.)在微流控芯片中PMMA表面上组装8-17E DNAzym进行荧光检测的方法(Dalavoy，T.S.；Wernette，D.P.；et al.LabChip，2008，8，786-793.)这些方法普遍具有选择性好、特异性强等特点，但操作繁琐，并不适合高通量的检测。

生物芯片是本世纪八十年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他物质的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化，能够实现对微量样品快速、准确的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于脱氧核酸酶的Pb²⁺检测芯片、制作方法及其使用方法，本发明将脱氧核酸酶和生物芯片的优点相结合，以实现对Pb²⁺低成本、高灵敏、准确、快速的检测。本发明的特征在于：利用具有Pb²⁺特异性强响应信号的脱氧核酸酶8-17DNAzyme，在Pb²⁺存在的情况下，17E酶链催化断裂为17DS底物链。具体地说，将合成的17E酶链固定在经修饰的玻片上；然后荧光标记的底物链17DS与玻片上的酶链杂交，形成双链结构，制备成Pb²⁺检测芯片；再加入待测样品，检测荧光信号。若待测样品中含Pb²⁺时，则Pb²⁺能够极大的提高17E酶链催化切断底物链的速度，底物链切断后，则荧光信号减弱。铅离子存在与否，可通过荧光扫描仪定量分析。

本发明提供的基于脱氧核酸酶的Pb²⁺检测芯片的制作方法，包括如下步骤：

(1)化学修饰的酶链17E固定在化学修饰的玻片上