[发明专利]一种基于脱氧核酸酶的铅离子检测芯片、制作及使用方法

权利要求书

1.一种基于脱氧核酸酶的铅离子检测芯片，其特征在于对具有特异性强响应的脱氧核酸酶8-17的17E酶链催化切断17DS底物链，切断后17DS底物链的部分或全部脱落。

2.按权利要求1所述的铅离子检测芯片，其特征在于所述的17DS底物链预先进行荧光标记，切断使荧光信号减弱。

3.制作如权利要求1或2所述的铅离子检测芯片的方法，其特征在于首先根据已知的脱氧核酸酶8-17的结构，设计相应的化学修饰的17E酶链和荧光修饰的17DS底物链，然后将末端修饰的17E酶链固定在经修饰的玻片上，最后将荧光标记底物链17DS与玻片上酶链杂交，形成脱氧核酸酶8-17双链结构。

4.按权利要求3所述的制作方法，其特征在于包括：

(1)化学修饰的酶链17E固定在化学修饰的玻片上

2-40μM化学修饰的17E按1∶1体积比加入2×点样缓冲液。通过以接触式Cartesian mocroarray制作系统点阵于化学修饰的载玻片。点样完毕，将玻片置于70％湿度、室温的条件下48～72h进行固定；并分别用0.2％SDS、去离子水洗2次，每次2min，然后用醛基封闭液封闭15min；再依次用0.2％SDS、去离子水各洗2次，每次2min，吹干；

(2)17DS底物链与17E酶链的杂交

标记了荧光的底物链17DS用杂交液稀释成1-10μM。将稀释好的底物链溶液加在芯片的斑点处，盖上盖玻片；芯片置于25℃湿盒中，12-16h后，将芯片置于4℃，30min，再25℃，15min；然后依次用0.2％SDS，2×SSC，0.2×SSC洗3min，吹干。

5.按权利要求4所述的制作方法，其特征在于所述的封闭液由0.1g硼氢化钠、30ml PBS和10ml质量百分含量为99％乙醇组成。

6.使用如权利要求1所述的铅离子检测芯片的方法，其特征在于使用所述的铅离子检测芯片进行铅离子的检测只需要将待测样品添加到芯片上，并保持一段时间，然后利用芯片信号分析系统扫描芯片，并对荧光信号进行分析；通过荧光信号的变化，实现对的Pb²⁺检测；样品中Pb²⁺浓度越高，荧光信号减弱越多。

7.按权利要求6所述的使用方法，其特征在于检测铅离子的浓度范围是1nM～10μM。

8.按权利要求6所述的使用方法，其特征在于用10mM Tris-HCl，pH7.2，50mM NaCl杂交液稀释制备好不同浓度的Pb²⁺，加不同浓度的Pb²⁺溶液于制备好的芯片斑点处，4℃，反应1h，再室温放置15min；再用缓冲液洗3次，吹干后用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray3000扫描照片并分析结果。

9.按权利要求8所述的使用方法，其特征在于：

a)使用探针Pb-1和Pb-2制备的芯片，检测不同浓度的Pb²⁺表明在Pb²⁺离子存在的情况下，芯片斑点处荧光强度减弱，当Pb²⁺浓度为10nM时，与缓冲液组的荧光强度相比，斑点处荧光强度减弱40％，随着Pb²⁺浓度增加，荧光信号逐渐减弱；

b)使用探针Pb-3和Pb-4制备的芯片，检测不同浓度的Pb²⁺表明在Pb²⁺离子存在的情况下，芯片斑点处荧光强度减弱，当Pb²⁺浓度为3nM时，与缓冲液组的荧光强度相比，斑点处荧光强度减弱15％，随着Pb²⁺浓度增加，荧光信号逐渐减弱；

c)使用探针Pb-1和Pb-2制备的芯片对Pb²⁺检测特异性表明，只有在Pb²⁺存在的情况下，芯片斑点处荧光强度大大减弱，Pb²⁺为10μM时，与缓冲液组的荧光强度相比，荧光强度减弱了95％；而当加入10μM其他二价金属离子，荧光强度只有1％～5％的微小的减弱，所以制备的芯片对Pb²⁺检测具有特异性；

所述的Pb-1的序列为5’-Cy5-ACTCACTATrAGGAAGAGATG-3’；

所述的Pb-2的序列为5’-NH₂-T12-CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGA

                  AATAGTGAGT-3’；

所述的Pb-3的序列为5’-TATGTCTGACTCACTATrAGGAAGAGA

                  TG-Cy5-3’；

所述的Pb-4的序列为5’CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATA

                  GTGAGTCAGACATA-T12-NH₂-3’。