[发明专利]蛋鸡肝细胞的制备方法无效

专利信息
申请号: 201010528886.9 申请日: 2010-11-03
公开(公告)号: CN101988048A 公开(公告)日: 2011-03-23
发明(设计)人: 董晓芳;佟建明;周筱丹 申请(专利权)人: 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
主分类号: C12N5/071 分类号: C12N5/071
代理公司: 暂无信息 代理人: 暂无信息
地址: 100193 北京市海淀区圆明*** 国省代码: 北京;11
权利要求书: 查看更多 说明书: 查看更多
摘要:
搜索关键词: 蛋鸡 肝细胞 制备 方法
【说明书】:

技术领域

发明属于医学生物技术领域,涉及蛋鸡肝细胞的制备技术。

背景技术

肝脏是禽类重要的器官,具有合成、代谢、解毒等功能。由于肝脏是家禽脂类代谢的主要场所,因此培养家禽肝细胞对研究脂类代谢具有重要意义。目前肝细胞的培养方法主要集中在哺乳动物上,但由于禽类的解剖结构与哺乳动物差异大,因此需要建立适合禽类的肝细胞制备方法。

禽类的肝细胞制备目前多采用离体灌流法和体内灌流法。采用离体灌流法制备的肝细胞活率低,剥离肝门静脉时会翻动肝脏,容易对肝脏造成损坏和污染,降低了肝细胞制备的成功率。因此离体灌流法还无法代替体内灌流法。体内灌流法目前集中于肉禽和雏禽肝细胞的制备。蛋禽因具有发达的输卵管静脉丛,输卵管静脉与肝门静脉相通,按原有的体内灌流法会导致灌流液无法完全进入肝脏,肝细胞制备失败。因此本发明的目的在于建立蛋鸡肝脏的体内灌流方法,进一步探求高质量的蛋鸡肝细胞分离技术,提供更为合理的蛋鸡肝细胞的制备方法。

发明内容

本发明的方案为一种蛋鸡肝细胞的制备方法,主要包括蛋鸡血管结扎、肝脏的体内灌流和肝细胞洗涤三个过程,其特征在于:所述蛋鸡血管结扎采用下述(1)-(5)过程:

(1)将消毒麻醉好的蛋鸡放入超净台,从腹部中间起始,拨开腹部和胸部皮肤;

(2)沿胸骨两侧第一根肋骨剪断,暴露肝脏;

(3)打开腹腔,轻轻把肠道拉向躯体左侧,结扎输卵管静脉、胰十二指肠静脉;

(4)于肠系膜后静脉下穿两条棉线,结扎远心端棉线,近心端棉线不结扎;

(5)在两条棉线之间用眼科剪将肠系膜后静脉剪开一个小口,沿肝门静脉方向插入小鼠灌胃针,并用近心端棉线结扎固定好灌胃针。

所述肝脏的体内灌流的过程为:

(1)以30毫升每分钟的速度灌注40℃预热的无菌灌流液A,待肝脏鼓胀变为土黄色时剪开上腔静脉,持续20分钟;

(2)以30毫升每分钟的速度灌注40℃预热的无菌灌流液B,持续10分钟;

(3)待流出的液体变清后,以20毫升每分钟的速度灌注42℃预热的无菌灌流液C,15分钟后肝脏塌陷逐渐消化完毕。

所述肝细胞洗涤的过程为:

(1)摘除灌好的肝脏,放入无菌平皿中,加入50毫升基础培养液,剔除血管、脂肪和结缔组织,剪去肝脏周边消化不完全的部分;

(2)用镊子撕开肝脏包膜,肝细胞会大量流出,大口径吸管轻轻吹打,随后分别过100目(150微米)、200目(75微米)及400目(30微米)细胞筛,所得肝细胞悬液用基础培养液清洗,并以500转每分钟的速度离心5分钟,弃上清后在用基础培养液再清洗一次,离心弃上清;

(3)用贴壁培养液重悬,台盼蓝拒染法检测细胞活力、血细胞计数板计数;

(4)细胞计数后,用贴壁培养液将细胞悬液稀释为1×106个细胞每毫升。

以上所述的无菌灌流液A每升中含有:2.383克HEPES、8.006克氯化钠、0.224克氯化钾、1.074克十二水合磷酸氢二钠、1.861克EDTA二钠盐,余量为去离子水,pH值为7.4。

以上所述的无菌灌流液B每升中含有:2.383克HEPES、8.006克氯化钠、0.224克氯化钾、1.074克十二水合磷酸氢二钠,余量为去离子水,pH值为7.4。

以上所述的无菌灌流液C每升中含有:0.4gⅡ型胶原酶、2.383克HEPES、8.006克氯化钠、0.224克氯化钾、1.074克十二水合磷酸氢二钠,0.6克氯化钙,余量为去离子水。

本发明在现有离体灌流分离蛋鸡肝细胞方法的基础上提出体内三步灌流方法,有效的提高了分离肝细胞的数量和活率。

具体实施方式

为进一步说明本发明的内容,以下通过具体方案进一步描述。

本方案以产蛋高峰期蛋鸡肝脏30克为例分离制备肝细胞。

下载完整专利技术内容需要扣除积分,VIP会员可以免费下载。

该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,未经中国农业科学院北京畜牧兽医研究所许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服

本文链接:http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201010528886.9/2.html,转载请声明来源钻瓜专利网。

×

专利文献下载

说明:

1、专利原文基于中国国家知识产权局专利说明书;

2、支持发明专利 、实用新型专利、外观设计专利(升级中);

3、专利数据每周两次同步更新,支持Adobe PDF格式;

4、内容包括专利技术的结构示意图流程工艺图技术构造图

5、已全新升级为极速版,下载速度显著提升!欢迎使用!

请您登陆后,进行下载,点击【登陆】 【注册】

关于我们 寻求报道 投稿须知 广告合作 版权声明 网站地图 友情链接 企业标识 联系我们

钻瓜专利网在线咨询

周一至周五 9:00-18:00

咨询在线客服咨询在线客服
tel code back_top