[发明专利]蛋鸡肝细胞的制备方法

权利要求书

1.蛋鸡肝细胞的制备方法，包括蛋鸡血管结扎、肝脏的体内灌流和肝细胞洗涤三个过程，其特征在于：所述蛋鸡血管结扎采用下述(1)-(5)过程：

(1)将消毒麻醉好的蛋鸡放入超净台，从腹部中间起始，拨开腹部和胸部皮肤；

(2)沿胸骨两侧第一根肋骨剪断，暴露肝脏；

(3)打开腹腔，轻轻把肠道拉向躯体左侧，结扎输卵管静脉、胰十二指肠静脉；

(4)于肠系膜后静脉下穿两条无菌棉线，结扎远心端棉线，近心端棉线不结扎；

(5)在两条棉线之间用眼科剪将肠系膜后静脉剪开一个小口，沿肝门静脉方向插入无菌的小鼠灌胃针，并用近心端棉线结扎固定好灌胃针。

2.按权利要求1所述蛋鸡肝细胞的制备方法，其特征在于：所述肝脏的体内灌流的过程为：

(1)以30毫升每分钟的速度灌注40℃预热的无菌灌流液A，待肝脏鼓胀变为土黄色时剪开上腔静脉，持续20分钟；其中无菌灌流液A每升中含有：2.383克HEPES、8.006克氯化钠、0.224克氯化钾、1.074克十二水合磷酸氢二钠、1.861克EDTA二钠盐，余量为去离子水，pH值为7.4；

(2)以30毫升每分钟的速度灌注40℃预热的无菌灌流液B，持续10分钟；其中无菌灌流液B每升中含有：2.383克HEPES、8.006克氯化钠、0.224克氯化钾、1.074克十二水合磷酸氢二钠，余量为去离子水，pH值为7.4；

(3)待流出的液体变清后，以20毫升每分钟的速度灌注42℃预热的无菌灌流液C，15分钟后肝脏塌陷逐渐消化完毕；其中无菌灌流液C每升中含有：0.4g Ⅱ型胶原酶、2.383克HEPES、8.006克氯化钠、0.224克氯化钾、1.074克十二水合磷酸氢二钠，0.6克氯化钙，余量为去离子水。

3.按权利要求1所述蛋鸡肝细胞的制备方法，其特征在于：所述肝细胞洗涤过程为：

(1)摘除灌好的肝脏，放入无菌平皿中，加入50毫升基础培养液，剔除血管、脂肪和结缔组织，剪去肝脏周边消化不完全的部分；

(2)用镊子撕开肝脏包膜，肝细胞会大量流出，大口径吸管轻轻吹打，随后分别过100目、200目及400目细胞筛，所得肝细胞悬液用基础培养液清洗，并以500转每分钟的速度离心5分钟，弃上清后再用基础培养液清洗一次，离心弃上清；

(3)用贴壁培养液重悬，台盼蓝拒染法检测细胞活力、血细胞计数板计数；

(4)细胞计数后，用贴壁培养液将细胞悬液稀释为1×10⁶个细胞每毫升。