[发明专利]一种高效生产L-缬氨酸的发酵工艺

说明书

【技术领域】：本发明涉及一种高效生产L-缬氨酸的发酵工艺，属于发酵法生产氨基酸的技术领域。

【背景技术】：L-缬氨酸(L-valine)属于分支链氨基酸，是人体必需氨基酸之一。近年来，由于氨基酸在食品、医药、饲料、农业和日用化工等方面有极其广泛的用途，尤其随着抗癌药物制剂、氨基酸输液制剂及甜味二肽生产的飞速发展，对原料氨基酸的需求量日益增长，市场需求量不断增加。最近，人们发现L-缬氨酸是合成一种免疫抗生素的重要中间体，其年消耗量猛增到数千吨，现在世界L-缬氨酸年产量已达到10000吨以上。在整个氨基酸生产工业中，随着氨基酸输液需求的不断增长，L-缬氨酸的需求也将增长，其生产已占有重要的地位。另外，缬氨酸在食品、化妆品和饲料工业上也有着广泛的应用。缬氨酸发酵是典型的代谢控制发酵。国内虽有天然蛋白质水解液分离提取L-缬氨酸的产品，但产量很低，质量不佳，纯度不高，无法实现大规模工业化生产。利用微生物发酵法生产L-缬氨酸具有原料成本低，反应条件温和及易实现大规模生产等优点，是一种非常经济的生产方法。但是，以微生物发酵法生产L-缬氨酸，国内大多数菌株的产酸水平不高，特别是L-缬氨酸的生产水平和产量远不能满足国内市场的需求。因此，开展发酵法生产L-缬氨酸的研究具有极其重要的意义。

而且，随着近年来原材料价格的不断上涨和市场竞争的愈加激烈，为了在提高缬氨酸产量和转化率的同时能够降低生产成本，仍有大量关于缬氨酸发酵方面的研究报道，主要集中在诱变选育缬氨酸高产菌株、发酵过程控制与优化和新原料的开发等方面。

缬氨酸生产菌属于营养缺陷型突变株，能在胞外大量积累缬氨酸是由于菌体的代谢处于异常状态，对环境条件非常敏感。发酵条件如碳源、氮源、无机盐、生物素、pH、温度及溶氧等对缬氨酸的合成都具有重要影响。其中，底物(如葡萄糖)浓度是控制菌体代谢过程的一个重要参数，主要通过控制相关酶的合成或活性影响菌体的代谢途径。葡萄糖可通过“葡萄糖效应”阻遏、抑制多种酶的合成，如氨基酸合成酶等，这种阻遏作用主要是其分解代谢物引起的。在以葡萄糖为碳源的缬氨酸发酵中，葡萄糖的分解代谢物阻遏会引起多种副产物如乳酸的积累，从而影响糖酸转化率。此外，溶氧也是一个至关重要的因素，杂酸的产生和碳架的浪费与溶解氧浓度密切相关。因此在发酵过程中必须控制恰当的溶氧值，以优化代谢流分布，增大L-缬氨酸产率，减少杂酸的生成。

目前，我国L-缬氨酸在生产工业上主要采用分批发酵模式。在这种生产模式中，维持一定的底物(如葡萄糖)浓度对于缬氨酸的发酵非常重要。为达到经济技术的要求，要提高单批次发酵过程中的缬氨酸产量就要提高初始培养基中的底物(如葡萄糖)浓度，但底物浓度过高会引起渗透压过大，影响菌体的正常代谢及缬氨酸的产量。反之，初始葡萄糖浓度较低有利于菌体的生长，但后期发酵液中的残糖迅速耗尽，其生产能力不能得到最大限度的发挥。与此同时，在目前的生产模式中，溶氧浓度往往不能得到很好的控制，溶氧水平浮动很大，不能长时间稳定的维持在一个恰当的水平上。在缬氨酸发酵过程中，由于L-缬氨酸合成不是经由三羧酸循环，而是由丙酮酸为前提物合成，当供氧不足时，葡萄糖降解通过TCA循环的氧化受到抑制，细胞内丙酮酸库水平提高，有利于前体物增加，从而导致L-缬氨酸产量增加。而溶氧过高时，乙酰乳酸合成酶酶活明显降低，且TCA循环流量加大，造成碳流损失；但溶氧过低时，TCA循环代谢流量减小，不足以平衡葡萄糖酵解速率，从而刺激了乳酸脱氢酶的酶活，使代谢流转向乳酸生成，造成乳酸积累。这两种情况均不利于缬氨酸生成。此外，现有的很多L-缬氨酸发酵培养基配方都不能很好的最大限度去满足其相应生产菌株的生长代谢和产酸要求。

【发明内容】：本发明的目的在于克服现有的缬氨酸生产方法发酵产酸量较低、糖酸转化率低等缺陷，提供一种高效发酵生产L-缬氨酸的方法。在不增加额外设备和人力投入的情况下，实现了整个发酵周期的缩短和L-缬氨酸产量和转化率的大幅提高，适合于工业化生产。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：本发明提供的一种高效发酵生产L-缬氨酸的方法，包括种子培养和进行发酵产酸，其特征是：发酵过程中，通过调节发酵罐搅拌转速和风量将溶氧控制在适当的水平上，整个发酵过程既不产生较多乳酸等杂酸副酸，也不导致由于TCA循环流量加大而造成碳源大量流失，通过流加液氨控制pH，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加一定较高浓度的葡萄糖溶液将残糖控制在一定水平，使整个发酵过程中既不产生葡萄糖抑制，也不构成底物限制，发酵至60h停止。

该方法的具体步骤如下：