[发明专利]用于测定莱克多巴胺的免疫生物传感器的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种化学检测技术领域的装置和方法，具体是一种采用三元复合纳米材料，应用于测定溶液中β-兴奋剂激素莱克多巴胺(RAC)的免疫生物传感器及其制备方法。

背景技术

莱克多巴胺(ractopamine，RAC)，属于β-兴奋剂，能使动物体内的营养成分由脂肪向肌肉转移，表现出营养再分配效应，进而调控动物体的物质代谢，增强脂肪分解，促进蛋白质合成，显著提高胴体瘦肉率和饲料报酬。但是，人类食用了残留有莱克多巴胺的动物食品后，会出现不同程度的中毒现象，它们的滥用及在动物性食品中的残留严重危害着人们的健康和生命安全，并严重影响了我国畜禽产品的出口贸易。所以我国和欧盟以及世界上大多数国家都明文禁止莱克多巴胺用作饲料添加剂。国家已经建立了《进出口动物源性食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林残留量的检测方法液相色谱一质谱/质谱法，SN/T 1924-2007》标准。但是与克伦特罗(瘦肉精)的检测相比，莱克多巴胺的检测还彰显不足，需亟待丰富和提高。因此，寻找莱克多巴胺快速准确的测定技术仍是人们的迫切期望，研究意义重大。

目前应用最多的莱克多巴胺测定方法主要有液相色谱法、气质联用法、高效液相色谱法和酶联免疫法等。但是这些分析方法需要大型分析仪器，操作过程繁琐，不能实现现场检测。本发明结合碳纳米管独特的电子特性和表面微结构，能很好地促进生物电活性分子的电子传递，并易于固定生物大分子并能保持其活性的特点；和纳米金颗粒具有比表面积大、生物亲和性高等优点；以及普鲁士蓝优异的电催化活性，和高稳定性、易制备等特点，建立了对莱克多巴胺检测的直接电化学生物传感器，得到较低的检出限和较宽的线性范围。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种用于测定莱克多巴胺的免疫生物传感器的制备方法，能很好地促进生物电活性分子的电子传递，并易于固定生物大分子并能保持其活性的特点；和纳米金颗粒具有比表面积大、生物亲和性高等优点；以及普鲁士蓝优异的电催化活性，和高稳定性、易制备等特点，建立了对莱克多巴胺检测的免疫电化学生物传感器，具有高选择性、低检出限和宽线性范围的特点。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过将纳米金、具有共轭键合偶联莱克多巴胺-牛血清白蛋白(BSA)的碳纳米管以及普鲁士蓝依次修饰到玻碳电极上，得到电化学免疫传感器。

所述的具有共轭键合偶联莱克多巴胺-牛血清白蛋白(BSA)的碳纳米管通过以下方式制备得到：

第一步、将多壁碳纳米管在70℃的H₂SO₄∶HNO₃体积比为3∶1的溶液中超声震荡6小时，得到功能化多壁碳纳米管，将功能化多壁碳纳米管分散在pH值为7.4的磷酸缓冲溶液中并超声振荡分散，得到碳纳米管分散液；

第二步、将上述分散物与2ml含有6mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液混合，然后在室温下搅拌20分钟。由此产生的混合物在13000r/m离心15分钟，丢弃上清液，重复第二步若干次以消除过量EDC；

第三步、将0.1mg/mL的莱克多巴胺抗原-BSA与上述溶液以体积比1∶1混合并搅拌后，置于13000r/m下离心15分钟并转移上清液，得到共轭的莱克多巴胺抗原-BSA-多壁碳纳米管结合物；

第四步、将第三步得到的结合物置于1mL5％BSA溶液中浸泡30分钟后，使用PBS缓冲溶液离心3次以上以消除游离的莱克多巴胺抗原与BSA，并将得到莱克多巴胺抗原-BSA-多壁碳纳米管在1mL的PBS缓冲溶液中重新溶解，搅拌形成均匀分散的具有共轭键合偶联莱克多巴胺-牛血清白蛋白(BSA)的碳纳米管。

所述的玻碳电极是指：直径为3mm且分别经1.0和0.3μm的Al₂O₃粉乳液打磨抛光后，在乙醇和水中各超声3min的玻碳电极；