[发明专利]一种水溶性菁染料Cy7的制备及纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物合成技术领域，特别是一种水溶性菁染料Cy7的制备及纯化方法。

背景技术

菁染料是指发色团共轭体系两端建立在N-N原子间的脒离子插烯物，具有较好的平面刚性结构或大的平面共扼体系，荧光量子产率高，荧光波长长，能很好地与DNA自身的淡蓝色荧光相区别，而且与DNA作用后荧光量子产率增强。因而，菁染料得到了人们越来越多的重视。

水溶性菁染料是性能优良的荧光标记染料，广泛用于抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。菁染料目前也是基因芯片测试用的首选荧光标记物。但由于菁染料，尤其是不对称菁染料的合成副反应多，副产物极性相近，产物的分离提纯非常困难。水溶性菁染料分子极性大，分离提纯更加困难。文献报道这类化合物多采用HPLC法用C-18反相柱纯化(Bioconjugate Chem.，1993，4(2)，105-111)。

吲哚类水溶性菁染料Cy3，Cy5，Cy7等是生物芯片、分子信标常用的荧光染料，特别是Cy7由于最大吸收光谱一般位于(700-900)nm的近红外区域，可以避开生物分子的自荧光背景干扰，近年来被广泛应用于DNA测序、生物大分子的定量测定、免疫分析检测等领域。目前美国的Amershan Pharmacia Biotech公司已有商品化的Cy3、Cy5、Cy7相关产品出售，但价格昂贵，售价达500美元/毫克。Cy3、Cy5的合成方法已有文献报道(华东理工大学学报，2002，28(2)，212-215)。但Cy7至今尚无任何中外文献报道其合成方法。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术分析，提供一种水溶性菁染料Cy7的制备及纯化方法，该方法操作简单、成本低，对于实现Cy7的国产化具有重要的现实意义。

本发明的技术方案：

一种水溶性菁染料Cy7的制备及纯化方法，步骤如下：

1)将1-乙基-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐与5-苯胺基戊二烯醛缩苯胺盐酸盐加入醋酸酐与醋酸混合溶液中，在氮气保护下进行反应，制得中间体1-乙基-2-(ζ-苯胺基甲基乙酮基)己烯基-3，3-二甲基吲哚-5-磺酸盐，不进行任何处理，直接进行下步反应；

2)将1-(ε-羧戊基)-2，3，3-三甲川吲哚-5-磺酸盐加入到上述中间体1-乙基-2-(ζ-苯胺基甲基乙酮基)己烯基-3，3-二甲基吲哚-5-磺酸盐与醋酸酐、醋酸和醋酸钾的混合溶液中，在氮气保护下进行反应，制得水溶性菁染料Cy7初级产品；

3)将上述Cy7初级产品采用制备薄层色谱法进行分离提纯，即以乙醇和醋酸的水溶液为展开剂，反复展开，刮下蓝色展开带，用甲醇淋洗硅胶，经抽率、浓缩，即可制得水溶性菁染料Cy7纯品。

所述1-乙基-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐与5-苯胺基戊二烯醛缩苯胺盐酸盐的摩尔比为1∶1.1，反应温度为70℃-120℃，反应时间为3-4h，醋酸酐与醋酸的体积比为2-5∶1。

所述1-(ε-羧戊基)-2，3，3-三甲川吲哚-5-磺酸盐与1-乙基-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐的摩尔比为0.4-1∶1，反应温度为70℃-120℃，反应时间为20-40min。

所述乙醇和醋酸的水溶液组成的体积比为乙醇∶醋酸∶水＝10∶3∶1。

本发明的结构式与合成路线：

水溶性菁染料Cy7的结构式如下：

本发明的合成路线如下：

本发明的积极效果：本发明制备及纯化的水溶性菁染料Cy7，广泛应用于DNA测序、生物大分子的定量测定、免疫分析检测等领域；该制备方法操作简单、成本低，对于实现Cy7的国产化具有重要的现实意义。

具体实施方式

实施例1：

1)中间体1-乙基-2-(ζ-苯胺基甲基乙酮基)己烯基-3，3-二甲基吲哚-5-磺酸盐的合成：

25ml双口瓶在氮气保护下，加入0.14g1-乙基-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸盐，0.15g 5-苯胺基戊二烯醛缩苯胺盐酸盐，3ml醋酸酐，1ml醋酸，加热至T＝100℃下反应3.5h。

2)水溶性菁染料Cy7初级产品的制备：

向上述反应液中加入0.08g1-(ε-羧戊基)-2，3，3-三甲川吲哚-5-磺酸盐，0.2g醋酸钾，2ml醋酸酐，1ml醋酸，在温度为100℃下反应30min；冷却后旋蒸部分醋酸，加入100ml乙酸乙酯，析出固体，抽滤，并用乙酸乙酯反复洗涤固体，得水溶性菁染料Cy7初级产品。