[发明专利]一种紫花苜蓿叶绿体遗传转化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，公开了一种紫花苜蓿叶绿体遗传转化的方法，通过该方法实现了绿色荧光蛋白在紫花苜蓿叶绿体中的表达。

背景技术

随着生物技术的发展，植物转基因技术获得了举世瞩目的成就。许多经过性状改良如抗病虫、抗除草剂、品质优良的转基因作物新品种相继问世并得到推广，给农业发展带来了巨大的推动作用。然而，传统的转基因技术以核基因组转化为主，仍存在一些亟待解决的问题，如外源基因表达量低甚至沉默、多基因共转化难、存在位置效应、具有环境安全的风险等。叶绿体转化技术的出现，为解决以上问题提供了一种有效的途径。

叶绿体是植物细胞的一种重要细胞器，它是植物进行光合作用的场所，还参与氨基酸、核苷酸、脂肪酸和淀粉等许多物质的生物合成过程。叶绿体具有自身的遗传物质，大多数高等植物叶绿体的基因组大小在120-160kb之间，是环状裸露的双链DNA分子，其基因的组织和表达特性与原核生物相似（Plant J, 1998/16 (5) //627～732）。叶绿体转化具有多重优势，第一，表达量高。每个植物细胞内含约有30-100个叶绿体，而每个叶绿体内又有100多个基因组拷贝，因此外源基因插入到叶绿体基因组中，可以大大提高外源基因的拷贝数，从而显著提高蛋白的表达量；第二，可以实现外源基因的定点整合。通过同源重组的方法把外源基因插入基因组的特定位置，从而克服位置效应；第三，实现多基因的一步转化。由于叶绿体基因表达具有原核生物基因表达的特征，可以构建多顺反子载体，同时完成多个基因的转化；第四，对生态环境安全和生物多样性的风险显著降低。因为绝大多数植物属于母性遗传，叶绿体在细胞质中，此方法获得的转基因植物可以避免由花粉引起的基因飘移。

叶绿体遗传转化的研究起步较晚，1988年，Boynton等首次用野生型叶绿体DNA转化了单细胞生物——衣藻一个突变体(atpB基因突变体)，使其完全恢复光合作用能力（Science, 1988/240//1534~1538），标志着叶绿体基因工程的诞生。1990年，Svab等实现了高等模式植物烟草叶绿体的稳定转化（PNAS, 1990/87//8526~8530），从而开启了高等植物叶绿体转化的新纪元。到目前为止，除烟草以外，已在拟南芥(Plant Cell Rep, 1998/ 18(1-2)//20~24)、马铃薯(The Plant Journal, 1999/19(2)//209~216)、番茄(Nature Biotechnology. 2001/19//870 ~875)、油菜（Transgenic Research, 2003/12(1) //111~114）、棉花（Plant Molecular Biology, 2004/56//203~216）、甘蓝（Plant Cell Rep，2007/26//1733~1744）、胡萝卜(Plant Physiology, 2004/136//2843~2854)、莴苣（Plant Molecular Biology，2005/58（6）//763~774）、矮牵牛（Transgenic Research，2004/13// 523~530）、大豆（Plant Molecular Biology，2005/58(5)//659~668）、杨树(Transgenic Research 2006/15(5)//637~646)、甜菜（Transgenic Research，2009/18(1)//17~30）、茄子（Transgenic Res，2010/19//113~119）等植物上获得了稳定的叶绿体转基因植株；另外，在单子叶植物水稻上也获得了非同质化的叶绿体转基因植株（Mol Cells，2006/21(3)//401~410）。

豆科植物是人畜主要的蛋白质来源，实现豆科植物的叶绿体转化，对于提高豆科植物的育种进程具有重要的意义。目前，豆科植物的叶绿体转化仅在大豆上有过成功的报道（Plant Molecular Biology，2005/58(5)//659~668）。紫花苜蓿是一种优良的豆科牧草，素有“牧草之王”的美称，对其叶绿体转化的研究对农牧业生产具有重要的意义。

发明内容

本发明公开了一种转化紫花苜蓿叶绿体的转基因方法，通过该方法获得了表达绿色荧光蛋白的叶绿体转基因紫花苜蓿。

本发明提供一种紫花苜蓿叶绿体基因组部分碱基序列（部分16S-trnI-trnA-部分23S），见SEQ ID NO:1。