[发明专利]一种紫花苜蓿叶绿体遗传转化的方法

权利要求书

1.紫花苜蓿叶绿体基因组部分碱基序列（部分16S-trnI-trnA-部分23S），见SEQ ID NO:1。

2.一种紫花苜蓿叶绿体转化质粒载体，其特征在于：该载体组合有叶绿体基因组中扩增16S核糖体RNA基因-异亮氨酸转移RNA基因（16S-trnI）片段，丙氨酸转移RNA基因-23S核糖体RNA基因（trnA-23S）片段，绿色荧光蛋白基因（gfp）、壮观霉素抗性基因（aadA）表达框及多克隆位点片段（gfp-aadA-MCS）。

3.权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：gfp-aadA-MCS片段位于16S-trnI片段和trnA-23S片段之间，片段的顺序从5'端到3'端依次是：16S-trnI片段、gfp-aadA-MCS片段和trnA-23S片段。

4.权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：gfp-aadA-MCS片段中，gfp-aadA表达框是多顺反子；其中启动子是烟草叶绿体16S rRNA操纵子的启动子Prrn；gfp基因采用T7噬菌体第10个基因的核糖体结合位点T7g10；aadA基因采用烟草叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基的核糖体结合位点；终止子采用烟草叶绿体rps16基因的终止子Trps16。

5.权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：gfp-aadA-MCS片段中，多克隆位点MCS的5'端有由烟草烟草叶绿体16S rRNA操纵子的启动子Prrn和烟草酪蛋白水解酶导肽clpPrbcL所构成的融合启动子PrrnPclpPrbcL；5'端有烟草叶绿体psbA基因的终止子TpsbA。

6.利用权利要求1所述质粒载体进行转基因获得的紫花苜蓿叶绿体转基因植株的转化体，其特征在于：其宿主为紫花苜蓿，其叶绿体基因组上整合了绿色荧光蛋白基因gfp和壮观霉素抗性基因aadA表达框，转化体具有壮观霉素抗性和绿色荧光蛋白表达。

7.一种紫花苜蓿叶绿体遗传转化的方法，包括如下步骤：

（a）基因枪法轰击叶片：把紫花苜蓿无菌苗的叶子剪下，把小叶剪开，小叶的背面朝上平铺在预培养培养基（MS0+30g/L蔗糖+0.25mg/L KT+2mg/L 2,4-D+8g/L琼脂）上过夜，基因枪轰击后的叶片放在黑暗下25℃恢复培养3天；

（b）筛选：把恢复培养后的叶片，横切成两段，背面朝下、分散平放到筛选培养基I（MS0+30g/L蔗糖+0.25mg/L KT+2mg/L 2,4-D+500mg/L spe+8g/L琼脂）上，在光下25℃进行筛选，每15-20天更换一次培养基I，待有抗性胚状体或者抗性愈伤组织长出，把抗性胚状体或抗性愈伤组织转移到新的筛选培养基I上继续培养两周，再把抗性胚状体转移到筛选培养基II（MS0+30g/L蔗糖+0.05mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA+625mg/L spe+8g/L琼脂）上，继续培养两周，把长大的胚状体转移到筛选培养基III（MS0+30g/L蔗糖625mg/L spe+8g/L琼脂）上培养20-30天，抗性胚状体萌发并生根长成抗性再生植株，此时把抗性植株剪下，插入瓶装的筛选培养基III中生根，至此第一轮筛选结束；第二轮筛选是将第一轮筛选获得的抗性植株的叶子剪下在筛选培养基I上以第一轮筛选的方法进行筛选，直至得到抗性植株；第三轮筛选方法和第二轮相同。