[发明专利]一种假单胞菌及用其对普瑞巴林中间体进行微生物转化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种假单胞菌(Pseudomonas sp.)和对普瑞巴林中间体进行微生物转化的方法，特别涉及对消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯进行微生物转化的方法。

背景技术

(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(简称(S)-CNDE)是合成普瑞巴林(Pregabalin，PGB)的关键手性中间体，其消旋物为2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(简称CNDE)。PGB是γ-氨基丁酸(GABA)的三位异丁基取代物，对神经性疼痛、癫痛症的辅助治疗显示出强大优势，且对伴有睡眠障碍的神经性疼痛病人有治疗效果。

普瑞巴林及其手性中间体的制备方法，主要可分为外消旋体拆分法和不对称合成法。目前报道的不对称合成方法往往需要昂贵的过渡金属或手性配体，操作条件比较苛刻，有机溶剂使用量太大。在拆分法中，化学拆分要找出一个合适的手性拆分剂十分苦难，难度大，费用高，且必需先合成外消旋目标产物，拆分的最高收率一般不会超过50％。相对地，利用微生物或酶拆分法具备立体选择性强，条件温和，成本较低，对环境友好，减少原料浪费等优点。2008年，辉瑞公司的Martinez等人利用脂肪酶作为拆分剂选择性地水解(S)-CNDE，得到(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸(简称(S)-CNME)的钾盐，再以其作为原料化学合成制备获得普瑞巴林，此化学-酶法工艺路线可使普瑞巴林收率高达45％，且能够大大减少有机溶剂的使用量，并实现了(R)-CNDE的有效循环利用。然而，这些酶催化剂价格较高，对底物的适用也存在一定的局限性。相对地，如果利用微生物作为拆分剂，则可大大降低原料成本，目前尚未见有关于利用假单胞菌(Pseudomonas sp.)对2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯进行微生物转化的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种假单胞菌及用其对普瑞巴林中间体进行微生物转化的方法。

为实现上述目的，发明人首次分离纯化到一株能高选择性水解CNDE的微生物菌株。经过16S rDNA和生理生化鉴定，该菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)属，命名为假单胞菌YZ05(pseudomonas sp.YZ05)。该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2010年9月17日，保藏号为CGMCCNo.4184。

本发明利用所述假单胞菌对普瑞巴林中间体进行微生物转化的方法，包括如下步骤：

(1)将保藏号为CGMCC No.4184的假单胞菌加入到培养基中进行发酵培养；

(2)按以下方案A或方案B对普瑞巴林中间体进行转化反应，得到转化液，所述普瑞巴林中间体为消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯：

方案A：将消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯直接加入经步骤(1)培养后的发酵液中进行转化反应，得到转化液；

方案B：将经步骤(1)培养后的发酵液离心得到湿菌体，先将所述湿菌体加入到磷酸缓冲溶液中，后再加入消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯进行转化反应，得到转化液；

(3)将所述转化液用溶剂萃取，将萃取得到的有机相脱水后蒸发溶剂得到(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯。

进一步地，在本发明步骤(2)的方案A中，所述消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯相对于所述发酵液的加入量为1～50g/L；在步骤(2)的方案B中，所述消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯相对于所述磷酸缓冲溶液的加入量为1～50g/L。

进一步地，在本发明步骤(2)的方案B中，所述湿菌体相对于所述磷酸缓冲溶液的加入量为20～100g/L。

进一步地，在本发明步骤(2)中，转化反应温度为25～45℃，转化反应时间为10～60h。

进一步地，在本发明步骤(2)的方案B中，所述磷酸缓冲溶液的浓度为0.1M、pH为5～9。

进一步地，在本发明步骤(1)中，所述发酵培养的培养温度25～40℃，培养1～4天。

进一步地，在本发明步骤(1)中，所述培养基的成分为：蛋白胨5～15g/L、甘油0～6g/L、酵母膏1～5g/L、硫酸铵0～4g/L、磷酸二氢钾0～4g/L、氯化钠0.5～10g/L和硫酸镁0～0.5g/L，所述培养基的pH值为6～8。

本发明方法相对于传统的化学拆分方法和不对称合成法具有以下优点：