[发明专利]基因修饰CDR3δ移植型γδT淋巴细胞及其抑癌用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因修饰细胞及肿瘤治疗领域。具体而言，本发明涉及对T淋巴细胞进行基因修饰以及通过所修饰的γ9δ2T淋巴细胞治疗肿瘤的领域。

背景技术

肿瘤的免疫治疗被人们寄予厚望，尤其是肿瘤特异性T淋巴细胞过继性免疫疗法被认为是有发展潜力的治疗策略。然而，目前实验性或临床性试验并没有出现令人满意的疗效。这可能与大多数肿瘤抗原性极其微弱甚至缺失、抗原提呈功能缺陷、表面MHC分子或协同刺激分子表达水平低下、荷瘤机体免疫抑制状态等因素密切有关。此外，肿瘤病人体内肿瘤特异性的细胞毒T淋巴细胞(CTL)数量少，在体外很难分离和扩增；体外长时间的培养难以维持其肿瘤识别的特异性及其抗肿瘤的能力；T细胞系或者T细胞克隆的产生费时，费力。这些因素都限制了T淋巴细胞过继性免疫治疗的广泛应用。

最近，有科学家应用基因工程技术能够使αβT淋巴细胞表达肿瘤特异性的T细胞受体，从而提高T淋巴细胞对肿瘤抗原的特异识别能力。众多实验室都获得了病毒特异性或肿瘤特异性的基因工程淋巴细胞，并且在体外和动物实验中证明了其抗肿瘤的能力。

然而，αβT细胞识别肿瘤抗原的MHC限制性使得基因修饰的αβT淋巴细胞的临床使用受到限制。肿瘤细胞表面MHC分子表达低下或者丢失，难以被基因修饰的αβT淋巴细胞识别，导致肿瘤免疫逃逸。而且，基因修饰的αβT淋巴细胞既要识别抗原，又同时识别递呈抗原的MHC分子，因此，临床应用时需要分离各种各样的不同MHC限制性抗原特异的T细胞克隆，并根据病人递呈的肽段的MHC分子类型来确定能够对肿瘤反应的TCR。目前发现的肿瘤抗原特异性的TCR数目很少，而且只是针对少数如黑素数瘤等癌症的肿瘤相关性抗原。再者，用于转染的αβT细胞受体主要识别蛋白抗原，很少识别另外两种类型的肿瘤抗原：碳水化合物和糖脂抗原。最后，内源性和外源性的α链和β链可能形成混合TCR，产生意外的抗原识别特异性，从而引发自身免疫性疾病。

作为T细胞群体的另一类，γδT细胞在抗肿瘤免疫治疗中具有独特的作用：①γδT细胞主要以MHC非限制性方式识别抗原，它克服了αβT细胞抗肿瘤免疫的MHC限制性的局限；②抗原识别谱广泛，如肽类、非肽类、醇类等，并且可识别αβT细胞不能识别的抗原，因此，在功能上可作为αβT细胞免疫监视的重要补充；③肿瘤浸润的γδT淋巴细胞表达Fc受体，在TCR-CD3复合体的表达或/和组装上有缺陷时，仍可传递信号，这是αβT细胞所不具备的；④通过细胞毒作用和产生细胞因子来发挥效应功能；⑤对血液系统肿瘤和实体瘤均有杀伤作用。

但是，用于治疗的γδT细胞制剂制备在方法上仍存在一些问题亟待解决。如中晚期肿瘤患者或化疗后患者体内免疫抑制，导致种子细胞数量减少和免疫活性下降，致使体外扩增细胞数量受限，难以达到治疗所需量的细胞制剂。因此，利用基因工程技术，制备足够数量的具有细胞肿瘤反应特异性的、无/低毒性的γδT免疫效应细胞的研究势在必行。

本实验室长期从事γδT细胞的研究，对γδTCR识别抗原的机制进行了深入的探讨。γδTCR的抗原识别位点主要存在于Vδ链的互补决定区(CDR)，其中CDR1和CDR2区是由胚系基因V编码，而CDR3区则是通过V(D)和J基因的体细胞重组形成的。以往的研究结果表明，γδTCR与BCR和抗体在结构上高度类似。CDR3长度分布图表明，抗体重链(H)和TCRδ链CDR3的长度变化最大，且较轻链(L)和γ链者明显的长。这些结构基础提示与抗体识别抗原过程中抗体重链CDR3序列起着关键识别作用一样，CDR3δ在γδT细胞识别抗原中也起着关键作用。

实验室前期对卵巢癌和正常卵巢组织中的TCRδ2-CDR3基因扫描及长度多态性分析的结果显示，正常卵巢组织中的TCRδ2-CDR3基因片段呈多克隆表达；相比之下，卵巢癌组织中的TCRδ2-CDR3基因片段则呈寡克隆表达。二者片段长度分布不均，后者长度分布更为广泛，并且具有更为明显的优势片段长度，这种长度分布差异显示γδT细胞在卵巢癌的免疫反应中有重要作用。

发明内容