[发明专利]一种快速检测西布曲明及其衍生物的胶体金层析试纸条及制备方法

权利要求书

1.一种快速检测西布曲明及其衍生物的胶体金层析试纸条，其特征在于：由衬板（1）和在衬板（1）上依次衔接的样品垫（2）、金标结合垫（3）、包被膜（4）和吸水垫（5）组成，金标结合垫（3）为吸附西布曲明及其衍生物的金标抗体的聚酯纤维毡，在包被膜（4）上有用西布曲明及其衍生物偶联的载体蛋白溶液包被直线式检测线T线（6），和用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C线（7），两条线竖向平行排列。

2.根据权利要求1所述一种快速检测西布曲明及其衍生物的胶体金层析试纸条，其特征在于：所述衬板（1）为不吸水的PCV韧性材料。

3.根据权利要求1或2所述一种快速检测西布曲明及其衍生物的胶体金层析试纸条，其特征在于：所述包被膜（4）为硝酸纤维素膜，或混合纤维素膜。

4.根据权利要求1所述一种快速检测西布曲明及其衍生物的胶体金层析试纸条，其特征在于：所述吸水垫（5）为植物纤维棉纸。

5.根据权利要求1所述一种快速检测西布曲明及其衍生物的胶体金层析试纸条，特征在于：所述西布曲明及其衍生物的金标抗体为胶体金标记的抗西布曲明及其衍生物的单克隆抗体复合物，所述偶联西布曲明及其衍生物的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA。

6.一种快速检测西布曲明及其衍生物的胶体金层析试纸条的制备方法，其特征在于：制备偶联西布曲明及其衍生物的载体牛血清白蛋白BSA，用于制备相应的检测线T线（6）；制备偶联西布曲明及其衍生物的载体鸡卵清白蛋白，用于制备单克隆抗体，制备西布曲明及其衍生物金标抗体，用于制备吸附西布曲明及其衍生物金标抗体的聚酯纤维毡；制备羊抗鼠IgG抗体，用于制备对照线C线（7），包括如下步骤：

（A）将西布曲明及其衍生物与载体牛血清白蛋白BSA/鸡卵清白蛋白OVA进行偶联制备人工合成抗原；

a、生成水溶性碳化二亚胺（EDC）：往反应瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺（DMF）及那非类原料或拉非类原料，并通N₂保护，在室温下进行搅拌，待二甲基甲酰胺（DMF）完全溶解后，快速称取浓度为 60%的氢化钠（NaH），并将其加入所述反应瓶中，搅拌50-70分钟，直至溶液无气泡产生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反应瓶中，注入完毕后，在室温下搅拌11-13小时，之后将反应液倾入水中分散，以氯仿进行提取，合并提取液，以无水Na₂SO₄进行干燥，之后过滤，再经过减压浓缩后得到固体，加入无水乙醚打浆洗涤所述固体，之后进行过滤，最后真空干燥得到新的固体，此固体为烷基化物；将无水乙醇和上述步骤所得的烷基化物加入新的反应瓶中，进行搅拌分散，再加入NaOH溶液，加热回流反应2小时，停止加热稍冷却后，将反应液转入单口瓶中，减压浓缩得糊状物，再加入水，以盐酸调节至pH值为7-9的液体，以氯仿进行提取，合并提取液，再用饱和食盐水洗一次，以无水Na₂SO₄干燥，过滤，减压浓缩得白色固体，用甲醇重结晶，得白色粉状固体，此固体为水溶性碳化二亚胺（EDC）；

b、生成人工合成抗原：将上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、二甲基甲酰胺（DMF）、半抗原化合物平衡至室温；取上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物，三者的摩尔比为：半抗原化合物：水溶性碳化二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺=1：8-12：13-16，将其置入圆底烧瓶，然后加入上述步骤中所得的二甲基甲酰胺溶解，为保证反应完全，在室温避光的条件下进行搅拌，最后生成的溶液记为二号反应液；当所述水溶性碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物在二甲基甲酰胺中反应完全后，现配载体蛋白溶液（BSA / OVA），将载体蛋白与硼酸缓冲液按1:0.15-0.2的量溶解于另一容器中的硼酸缓冲液，然后转入另一圆底烧瓶中，此溶液记为三号反应液；将二号反应液按每10秒1滴的速度滴入三号反应液中，直至将二号的反应液加完后，先在室温避光的条件下进行搅拌，之后在3-5℃条件下避光搅拌，待反应完全后，生成溶液，并将生成的溶液记为四号反应液，四号反应液中载体蛋白与半抗原化合物比例为：1:15-25；等所有反应结束后，将四号反应液置于20000-30000分子截留透析袋中，透析袋中还装有0.01-0.02M磷酸盐缓冲液，pH值为7.0-7.5，将透析袋在3-5℃的条件下进行透析，每隔3-5小时换一次磷酸盐缓冲液；经上述透析步骤最终所得的产品，经冷冻干燥为白色絮状产品，即为人工合成抗原；

（B）将人工合成抗原OVA按常规方法免疫制备西布曲明及其衍生物的单克隆抗体细胞株，用Babc小鼠免疫制备抗体腹水，将腹水纯化得到高纯度的单克隆抗体蛋白，测定蛋白浓度，备胶体金标记用；

（C）用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm的胶体金溶液；

（D）用0.1mol/LK2CO3调节胶体金溶液至最适PH值（8.5-9.0），将适量纯化的单克隆抗体纯水透析（4hr）后，加入胶体盆中，室温电磁搅拌（15-30min），逐滴加入1%络蛋白溶液，使络浓度为0.1%，持续搅拌5min，4℃下15000rpm离心10min，弃去上清去沉淀物，将沉淀物用重悬液重新恢复至原体积混匀，再次离心一次，用重悬溶液将沉淀物混悬至原体积1/20,4℃保存备用，即获得抗西布曲明及其衍生物单克隆抗体的胶体金标记物，所述重悬液为含5%海藻的0.02Tris-HCL缓冲液；

 （E）将1：20-1:10稀释的西布曲明及其衍生物胶体进标记抗体喷涂吸附于聚酯纤维毡中，27℃保温干燥，制备西布曲明及其衍生物金标结合垫（3）；

（F）在包被膜（4）上用西布曲明及其衍生物偶联的载体牛血清白蛋白BSA溶液包被直线式检测线T线（6），用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C线（7），两条线竖向平行排列；

（G）试纸条的组装：将样品垫（2）、金标组合垫（3）、包被膜（4）和吸水垫（5）依次粘附在衬板（1）上，样品垫（2）置于衬板（1）的一端，吸水垫（5）置于衬板（1）的另一端，包被膜（4）置于衬板（1）的中间，金标结合垫（3）置于样品垫（2）和包被膜（4）之间，即得到用于免疫检测的西布曲明及其衍生物胶体金层析检测试验纸大板，将大板按顾客要求分切成2.5mm-7.0mm宽度规格的试纸条，密封干燥保存。