[发明专利]一种胰激肽释放酶分离纯化的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种医药原料中间体-胰激肽释放酶分离纯化的方法。

背景技术

激肽释放酶(kallikein)，是一种具有重要临床价值的生化药物，具有舒展毛细血管和小动脉的作用，在临床上常用来治疗高血脂，防治脂肪肝、动脉粥样硬化、高血压、心绞痛等多种疾病。

目前全球胰激肽释放酶的生产厂家仅有二十多家，大部分分布在我国境内，其中包括北京恒业中远化工有限公司、重庆创龙经贸有限公司等11家公司。市场上现有的胰激肽释放酶产品主要是从猪胰脏中提取，然而，以猪胰脏为原料提取胰激肽释放酶对环境污染较大，能耗以及物耗较高，随着国家对环境以及节能减排的要求日益严格，以猪胰脏作为提取原料势必被淘汰。尽管已有实验室报道成功构建了人组织激肽释放酶的真核表达系统和原核表达系统，但由于其存在表达量低、产物活性低等缺点，至今仍主要依靠实验室理论研究。因此，越来越多企业开始致力于转向利用胰酶粉为原料提取胰激肽释放酶工艺路线的研究，同时联产胰蛋白酶以及糜蛋白酶等。

国际上基于胰激肽释放酶的研究大多采用阴离子交换结合阳离子的方法，利用离子交换树脂分离纯化胰激太释放酶仍是目前最具产业化应用前景的一种分离方法。然而，利用离子交换树脂分离纯化激肽酶最大的问题之一是色素类物质以及油脂类物质对树脂的污染，降低了树脂的使用寿命。对于该问题，目前多采用高速离心除去大颗粒物质后用活性碳对其进行脱色的方法予以解决。实验表明利用活性碳对浸提液进行脱色，效果并不理想，同时，浸提液中含有一定量油脂，活性碳无法对其进行脱除。

我国发酵工业发展迅速，每年发酵工业在消耗粮食的同时，也产生了大量的发酵菌丝体。菌丝体除啤酒和白酒行业产生的菌丝体主要作为饲料或用于制取酵母粉外，其他菌丝体在应用方面都存在一定问题，如青霉素发酵菌丝体中含有青霉素，制成饲料可增加畜禽的抗药性，欧盟和美国都已明确规定青霉素菌丝体不能作为饲料添加剂。此外，将柠檬酸发酵菌丝体制成饲料会容易引起畜禽产生脱毛现象等，目前欧盟和美国也禁止将其作为饲料添加剂。这导致了发酵工业产生大量的废弃菌丝体污染物，正是这个原因，国外主要发达国家纷纷将这些发酵工业转移到发展中国家。目前，我国将发酵工业废弃菌丝体部分作为饲料添加剂(如酵母、青霉素菌丝体、谷氨酸菌丝体等)，以补充氮源。其他一些菌丝体如有机酸菌丝体则主要是废弃。这不但是资源的巨大浪费，亦将造成环境的严重污染。

本发明探究采用菌体对胰酶粉浸提液进行脱色除脂，脱色效果明显高于活性碳，同时油脂类物质也被菌体所吸附，降低了色素以及油脂类物质对树脂的污染，提高了树脂的使用寿命，同时也降低了胰激肽释放酶的分离成本。该技术目前还未有文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种胰激肽释放酶分离纯化的方法，主要是利用产富马酸根霉菌废弃菌体对胰酶粉浸提液中色素和油脂进行脱除的方法。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种胰激肽释放酶分离纯化过程中脱色除脂的方法，该方法利用根霉菌发酵产富马酸得到的废弃菌体经碱处理后，再加入胰酶粉浸提液中进行吸附反应，从而对胰酶粉浸提液脱色除脂。

本发明所述的废弃菌体是将根霉菌经培养得到的菌球进行富马酸发酵结束后，纱布过滤得到的。

所述的碱处理是将废弃菌体在0.2～2.Omol/LNaoH溶液中煮沸后保持20～30min，纱布过滤取出菌体，用去离子水洗至中性，得到产富马酸根霉菌废弃菌体。碱处理使根霉菌菌体在碱性环境下结构发生变化，使菌体更利于对胰酶粉浸提液中色素以及油脂的吸附。

所述的吸附反应采用的PH4.5～7.5，优选PH5.5～6.0；温度4～10℃，优选为6～8℃；吸附时间为1～12h，优选为6～8h。经碱液处理后得到的产富马酸根霉菌废弃菌体的直径为0.5-2.0mm，优选为1.0-1.5mm。胰酶粉浸提液中产富马酸根霉菌废弃菌体添加量为5g/L-20g/L，优选为10g/L-15g/L。

所述的胰酶粉浸提液的制备方法是使用去离子水溶解胰酶粉得到酶液，水和胰酶粉的重量比为30∶1～60∶1，调节酶液pH4.5～5.5，充分混合后进行高速离心，抽取上清液即胰酶粉浸提液。可采用1mol/L乙酸以及NaOH溶液调节酶液pH值。其中，所述的充分混合可通过摇床对酶液进行充分混合，摇床温度4～10℃、转速100～200r/min，混合反应时间达12～14h。高速离心为在温度为4～10℃条件下，离心速率为8000～12000r/min，离心时间为20～30min。