[发明专利]一种新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因重组技术，特别针对新孢子虫tNcSRS2基因的克隆与表达及rELISA抗体检测试剂盒的构建。

背景技术

新孢子虫病是1998年新发现的多种家畜共患的一种原虫病。犬是新孢子虫的终末宿主，牛、羊等多种哺乳动物以及野生动物可作为其中间宿主。该病呈世界性分布，50多个国家都有报道。在国外奶牛感染率为10～40％，最高可达82％，已证实新孢子虫病为患畜发生流产的主要根源。新疆是我国重要的畜牧业生产基地，养殖牛业又是我区的主要支柱产业，其血清新孢子虫抗体的阳性率为40％；每年有近5-20％的妊娠母牛发生不明原因的流产，布氏杆菌等感染性流产因素的检测结果均为阴性，难以确诊，造成巨大的经济损失；再加上我区每年引进一些高产奶牛，具有新孢子虫病引入感染的危险。

文献检索披露：国内用ELISA方法进行牛新孢子虫病血清学诊断及流行病学调查的报道有之。①有意大利Euroclone公司产的“Neospora caninum ELISAkit”和美国IDEXX公司产的“Neospora caninum Antibody Test kit”的检测试剂盒，其价格昂贵，针对性不强，有一定的局限性。②刘晶等在“新孢子虫dNcSRS2重组蛋白间接ELISA的建立及其应用”一文中，利用新孢子虫体外重组表面蛋白dNcSRS2蛋白作为包被抗原，建立了检测新孢子虫血清抗体的间接ELISA方法。③余劲术等在“新孢子虫NcSRS2基因的亚克隆和表达”一文中所研究的pGEX-NcSRS2重组质粒为日本国家原虫研究所惠赠的。他们根据NcSRS2基因序列设计合成一对引物，将上、下游引物分别引入EcoRI，XhoI酶切位点，用PCR技术从pGEX-NcSRS2重组质粒扩增截去N端疏水氨基酸序列NcSRS2的基因片段(称dNcSRS2)，插入到pGEX-6p-1质粒后转化大肠杆菌，诱导表达、纯化。④徐雪平等在“新疆部分地区牛新孢子虫病的血清学调查”一文中，应用国外试剂盒检出了1例新疆新孢子虫抗体阳性牦牛。本发明获取的新孢子虫株tNcSRS2基因的克隆与表达及rELISA检测试剂盒的构建及使用，既降低成本又经济实惠，为畜牧业的生产安全提供了高效的防护措施，也确实解决了高端产品贫民化使用的需求。

发明内容

本发明的目的在于：提供的新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒，为牛新孢子虫病的诊断与流行病学调查提供有效的科学与技术手段；该试剂盒与商品化ELISA检测试剂盒的符合率均达到95％以上。

本发明的目的是这样实现的：一种新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒，根据GenBank中的新孢子虫NcSRS2基因序列设计一对引物，引入酶切位点，截去NcSRS2蛋白的信号肽区，从新疆地方奶牛阳性血清中提取DNA；通过PCR扩增了长约975bp的tNcSRS2基因片段，克隆到pMD-18-T载体上，酶切并测序鉴定；然后将目的片段进一步定向连接到pGEX-4T-2表达载体，转化到大肠杆菌中，诱导表达、纯化；表达融合蛋白的分子量约为62kDa；用于ELISA包被抗原，获取rELISA抗体检测试剂盒，其试剂盒的使用；

操作步骤如下：

(1)取出酶标反应板，甩去板内的包被缓冲液，用移液器向每个微量孔中加200μL洗涤缓冲液，室温静置2分钟，然后甩出板中的液体，重复上步洗涤过程两次即可；

(2)封闭：每孔加入200μL自配的0.5％的脱脂乳，置于37℃生化培养箱中培养1小时待用；

(3)洗涤：用移液器向每个微量孔中加200μL洗涤缓冲液，室温静置2分钟，然后甩出板中的液体，重复上步洗涤过程两次即可；

(4)检测样品：将待检血清样用稀释缓冲液按1∶100稀释，加入酶标反应板中，每孔100μL；同时加入标准阳性血清和标准阴性血清；置于37℃生化培养箱中培养1小时待用；

(5)第三次洗涤：同步骤(3)；

(6)加二抗：将辣根过氧化物酶标记羊抗牛IgG抗体用稀释缓冲液进行1∶4000稀释，加入酶标反应板中，每孔100μL，置于37℃生化培养箱中培养1小时待用；

(7)第四次洗涤：同步骤(3)；

(8)显色：在各反应孔中加入配制的TMB溶液100μL，置于37℃生化培养箱中培养25min，在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，在酸的作用下转化成最终显黄色，颜色的深浅与样品的血清阳性强度呈正相关。

(9)终止反应：在各反应孔中加入2M硫酸50μL，即为反应终止；