[发明专利]一种新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒

权利要求书

1.一种新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：根据GenBank中的新孢子虫NcSRS2基因序列设计一对引物，引入酶切位点，截去NcSRS2蛋白的信号肽区，从新疆地方奶牛阳性血清中提取DNA；通过PCR扩增了长约975bp的tNcSRS2基因片段，克隆到pMD-18-T载体上，酶切并测序鉴定；然后将目的片段进一步定向连接到pGEX-4T-2表达载体，转化到大肠杆菌中，诱导表达、纯化；表达融合蛋白的分子量约为62kDa；用于ELISA包被抗原，获取rELISA抗体检测试剂盒，其试剂盒的使用；

操作步骤如下：

(1)取出酶标反应板，甩去板内的包被缓冲液，用移液器向每个微量孔中加200μL洗涤缓冲液，室温静置2分钟，然后甩出板中的液体，重复上步洗涤过程两次即可；

(2)封闭：每孔加入200μL自配的0.5％的脱脂乳，置于37℃生化培养箱中培养1小时待用；

(3)洗涤：用移液器向每个微量孔中加200μL洗涤缓冲液，室温静置2分钟，然后甩出板中的液体，重复上步洗涤过程两次即可；

(4)检测样品：将待检血清样用稀释缓冲液按1∶100稀释，加入酶标反应板中，每孔100μL；同时加入标准阳性血清和标准阴性血清；置于37℃生化培养箱中培养1小时待用；

(5)第三次洗涤：同步骤(3)；

(6)加二抗：将辣根过氧化物酶标记羊抗牛IgG抗体用稀释缓冲液进行1∶4000稀释，加入酶标反应板中，每孔100μL，置于37℃生化培养箱中培养1小时待用；

(7)第四次洗涤：同步骤(3)；

(8)显色：在各反应孔中加入配制的TMB溶液100μL，置于37℃生化培养箱中培养25min，在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，在酸的作用下转化成最终显黄色，颜色的深浅与样品的血清阳性强度呈正相关。

(9)终止反应：在各反应孔中加入2M硫酸50μL，即为反应终止；

(10)用酶标仪在450nm、630nm双波长处测定吸光度(OD值)，读OD_450/630nm值，判定其结果。

其关键数据的控制：抗原的包被浓度为7μg/mL，其反应时间为1h；封闭液为0.5％的脱脂奶粉，其封闭时间为1h；血清的稀释倍数为1∶100，其反应时间为1h；二抗稀释倍数为1∶4000，其反应时间为1h；显色时间为25min；包被缓冲液为0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液，洗涤液和稀释液均为PBST(pH7.4PBS+0.05％吐温20)，封闭液为0.05％脱脂乳(PBST+0.05％脱脂乳)。

2.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于：选用的标准阳性血清为新孢子虫病临床阳性血清，经美国IDEXX试剂盒测定，由本实验室保存。

3.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于：选用的标准阴性血清为新孢子虫病临床阴性血清，经美国IDEXX试剂盒测定，由本实验室保存。

4.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于：选用的辣根过氧化物酶标记羊抗牛IgG抗体购自美国的BETHYL公司。

5.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于：选用的pMD-18-T载体购自大连的TaKaRa公司。

6.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于：结果是当OD_450/630值≥0.170时，判定为阳性；当OD_450/630值＜0.121时，判定为阴性；当0.121≤OD_450/630值＜0.17时，判定为疑似阳性；判定为疑似阳性需重新检测，检测仍为疑似阳性时，判定为阳性。

7.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于：检测盒也适用于反刍动物的血清和血浆中的犬新孢子虫抗体的酶联免疫检测。

8.根据权利要求1所述的抗体检测试剂盒，其特征在于：检测盒配制的试剂及材料均为市售产品。