[发明专利]应用双亲性多孔中空碳微球制备固定化酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用双亲性多孔中空碳微球制备固定化酶的方法。

背景技术

酶是一类具有催化活性的蛋白质，能够在温和的反应条件下高效、高选择性的催化复杂的化学反应。但是天然酶稳定性差、易失活、以及难回收再利用的缺陷阻碍了酶催化的发展和应用，而且在反应体系中分离和提纯酶也增加了其作为催化剂的成本。如果能够实现酶的固定化，将水溶性酶蛋白变为不溶性固体催化剂，不仅可以在一定程度上提高酶的稳定性、活性和专一性等性能，更重要的是能够轻易实现酶的回收再利用以及产物的分离提纯，保证酶催化在工业应用中的经济可行。

酶固定化方法一般可粗分为4大类：吸附法、共价结合法、交联法和包埋法。包埋法固定化酶是在载体制备过程中将酶包埋在里面，适用于小分子量的酶的固定化，存在酶易泄漏，传质阻力等缺陷。共价结合法固定化酶使得酶与载体的结合很牢固，稳定性好，但是固定化成本高，操作过程繁琐复杂。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用双亲性多孔中空碳微球制备固定化酶的方法。

本发明提供的制备固定化酶的方法，包括如下步骤：将双亲性中空碳微球和待固定酶的溶液混合，4-45℃(如4℃-25℃、25℃-30℃、30℃-45℃)反应0.5-24h(如0.5h-2h、2h-6h、6h-12h、12h-24h)，得到固定化酶；所述双亲性中空碳微球按照如下方法制备：在恒温条件下，将酵母在水溶液或水中进行碳化，得到双亲性中空碳微球；所述恒温的温度为180-240℃之间的任一温度(如180℃-200℃或200℃-240℃)。

所述恒温的时间可为8-14小时(8小时-10小时或10小时-14小时)。

所述酵母可为啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，具体可为安琪酵母股份有限公司生产的耐高温高活性啤酒酵母。

所述水溶液可为己二醛水溶液、NaOH水溶液或HNO₃水溶液。所述酵母与所述水溶液的配比可为10-200g酵母∶1L水溶液，优选为200g酵母∶1L水溶液。所述己二醛水溶液具体可为0.01mol/L己二醛水溶液。所述NaOH水溶液具体可为1g/100mLNaOH水溶液。所述HNO₃水溶液具体可为1g/100mL HNO₃水溶液。

所述待固定酶可为水解酶、氧化还原酶、脱氢酶或异构酶等；所述水解酶可为脂肪酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等；所述氧化还原酶可为过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶等；所述脱氢酶可为乙醇脱氢酶等。所述异构酶可为葡萄糖异构酶等。

所述固定化酶具体可为固定化脂肪酶；所述待固定酶的溶液由游离脂肪酶和0.02mol/L pH6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液组成，脂肪酶浓度为4mg/mL；所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为0.05g∶2mL；所述反应的参数为：4-25℃，振荡(100rpm)反应12h。

所述固定化酶具体可为固定化过氧化氢酶；所述待固定酶的溶液由游离过氧化氢酶和0.05mol/L pH7.0的NaH₂PO₃-Na₂HPO₃缓冲液组成，过氧化氢酶浓度为20-50mg/mL；所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为0.05g∶4mL；所述反应的参数为：4-25℃，振荡(100rpm)反应0.5-24h。

所述固定化酶具体可为固定化葡萄糖氧化酶；所述待固定酶的溶液由游离葡萄糖氧化酶和0.05mol/L pH5.5的NaH₂PO₃-Na₂HPO₃缓冲液组成；葡萄糖氧化酶浓度为20mg/mL；所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为0.05g∶2mL；所述反应的参数为：30℃，振荡(100rpm)反应6h。

所述固定化酶具体可为固定化β-葡萄糖苷酶；所述待固定酶的溶液由游离β-葡萄糖苷酶和0.05mol/L pH4.8的HAc-NaAC缓冲液组成，β-葡萄糖苷酶浓度为1mg/mL；所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为0.05g∶1mL；所述反应的参数为：45℃，振荡(100rpm)反应2h。

以上任一所述方法制备得到的固定化酶也属于本发明的保护范围。