[发明专利]一种大黄鱼hepcidin抗菌肽及其制备方法

权利要求书

1.一种大黄鱼hepcidin抗菌肽，其特征在于其氨基酸序列如下：

Met Val Pro Ala Asn Glu Glu Gln Glu Leu Glu Gln Gln Ile Tyr Phe

1               5                   10                  15

Ala Asp Pro Glu Met Pro Val Glu Ser Cys Lys Met Pro Tyr Tyr Met

20                  25                  30

Arg Glu Asn Arg Gln Gly Ser Pro Ala Arg Cys Arg Phe Cys Cys Arg

35                  40                  45

Cys Cys Pro Arg Met Arg Gly Cys Gly Ile Cys Cys Arg Phe Leu Glu

50                  55                  60

His His His His His His

65

其中N端含有表达起始密码子的Met蛋白，C端连接有6个His标签和Xho I酶切位点翻译后的2个氨基酸：Leu和Glu。

2.一种大黄鱼hepcidin抗菌肽基因，其特征在于其序列如下：

gcgccatggt cccagccaat gaagagcaag agctggagca gcaaatttat tttgctgatc   60

cagagatgcc agtggaatca tgcaagatgc cgtattacat gcgtgagaat cgtcagggca  120

gccctgctag atgcaggttt tgctgccgtt gctgtcctag aatgagggga tgtggtatct  180

gctgcaggtt cctcgag cgg                                             200

其中Nco I酶切位点为CCATGG，Xho I酶切位点为CTCGAG。

3.一种大黄鱼hepcidin抗菌肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)克隆大黄鱼hepcidin抗菌肽基因，并将大黄鱼hepcidin抗菌肽基因插入表达载体，构建携带大黄鱼hepcidin抗菌肽基因的重组表达载体；将所述大黄鱼hepcidin抗菌肽基因的重组表达载体转化到大肠杆菌中，选取转化后大肠杆菌中的阳性克隆于培养基中进行培养，提取质粒；

2)将步骤1)中的所得质粒转化到大肠杆菌中，选取转化后大肠杆菌中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养，离心收集发酵后的大肠杆菌细胞，重悬所述大肠杆菌细胞于悬菌磷酸缓冲液中，再次离心，弃上清，将沉淀溶于变性液中，得混合溶液；

3)测定混合溶液中蛋白浓度，调节蛋白浓度，加入氧化液，再加入复性液，离心，过滤，即得大黄鱼hepcidin抗菌肽蛋白粗提物；

4)纯化大黄鱼hepcidin抗菌肽蛋白粗提物，即得大黄鱼hepcidin抗菌肽。

4.如权利要求3所述的一种大黄鱼hepcidin抗菌肽的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述表达载体为原核表达载体pET-28a⁺。

5.如权利要求3所述的一种大黄鱼hepcidin抗菌肽的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述大肠杆菌为E.coli TOP10F′，所述培养基为含有卡那霉素和D-葡萄糖的LB培养基；所述培养条件为：37℃，180rpm培养8h，所述提取质粒采用常规小量质粒提取试剂盒进行提取。