[发明专利]一种制备β-内酰胺酶抑制多肽的方法及所用的表达载体

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，特别涉及一种制备β-内酰胺酶抑制多肽的方法及所用的表达载体、融合蛋白等。

背景技术

β-内酰胺类抗生素(包括青霉素和头孢菌素)在临床上用于治疗多种细菌感染疾病，但随着抗生素的广泛应用以及某种程度上的滥用，耐药菌在不断地产生，它们对许多β-内酰胺抗生素耐药，从而使这类药物对耐药菌感染的疾病无效。微生物来源的β-内酰胺酶的抑制剂棒酸(Clavulanic acid)及其β-内酰胺砜类化合物舒巴坦(Sulbactam)和他佐巴坦(Tazobactam)，均在七十年代至八十年代被发现并证实是有效的β-内酰胺酶抑制剂，且作为“自杀者”与β-内酰胺抗生素合并用药，可达到抑制β-内酰胺酶活力、增强β-内酰胺抗生素疗效的目的。然而，这些小分子化合物对一些细菌产生的由染色体介导的I型β-内酰胺酶的抑制作用都很小。

近来人们从带棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)中分离到一种β-内酰胺酶抑制蛋白(β-lactamase inhibitory protein，BLIP)，可以特异性的抑制β-内酰胺酶的活性，随后又有BLIP-I、BLIP-II被发现。但是β-内酰胺酶抑制蛋白BLIP分子量比较大，有165个氨基酸组成，并不适合开发成为临床使用的药物。BLIP与β-内酰胺酶的结合具有几个关键结合位点。本发明人曾经根据关键结合位点设计并合成了随机寡核苷酸库，从中筛选到24肽SIPIS04-01，体外作用表明具有抑制β-内酰胺酶的活性，适合用于作为基因工程表达药物，但是该24肽SIPIS04-01的抑制β-内酰胺酶的活性并不高。经过氨基酸替换得到对β-内酰胺酶抑制活性更高的多肽P1-A(已经申请中国发明专利，申请号：200910054340.1。P1-A为SIPIS04-01-N-Y50A-36，其是序列为AMADIGSQFMFRFTIHCSVTAAGDAYCYHGANGTSF的36肽)。但是该多肽P1-A的生产和纯化的难度以及成本都比较高，这制约了进一步的研究和以后的产业化。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的制备β-内酰胺酶抑制多肽的方法存在纯化难度大，成本高的不足，提供一种新的制备β-内酰胺酶抑制多肽的方法，该方法可以大大降低β-内酰胺酶抑制多肽的制备纯化难度和成本。

本发明人经过广泛的研究和反复的试验，惊喜的发现，现有的β-内酰胺酶抑制多肽P1-A融合蛋白表达后需要经肠激酶酶切除去His tag，该酶切效果并不理想，而且重组肠激酶的价格也比较高，这是造成多肽P1-A纯化的难度和成本都比较高的原因。而烟草蚀斑病毒(Tobacco etch virus，TEV)蛋白酶是另-种常用于切割融合蛋白的蛋白酶，对识别位点具有高特异性并在宽的温度范围里具有切割活性。因此，本发明人尝试用TEV蛋白酶酶切位点替换肠激酶酶切位点来表达和纯化β-内酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白，首先构建了含有TEV蛋白酶识别序列的P1-A表达载体，然后利用TEV蛋白酶切策略纯化多肽P1-A，同时，研究多肽P1-A的分离纯化工艺，制备纯化的β-内酰胺酶抑制多肽最终达到了具有抑制肺炎克雷伯氏菌的效果，从而完成了本发明。

因此，本发明的第一方面是：一种制备β-内酰胺酶抑制多肽的方法，包括以下步骤：

1)构建一种表达β-内酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白的重组表达载体，该β-内酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白是β-内酰胺酶抑制多肽-TEV蛋白酶切割位点-His tag的融合蛋白；

2)用步骤1)所述的重组表达载体转化宿主细胞，得转化子；

3)培养步骤2)所述的转化体，表达所述的His tag融合蛋白；

4)用金属螯合亲和层析法从步骤3)所得的培养物中纯化获得His tag融合蛋白；

5)用TEV蛋白酶酶切步骤4)纯化得到的His tag融合蛋白；和

6)用凝胶柱层析法从步骤5)得到的酶切物中分离纯化获得β-内酰胺酶抑制多肽。