[发明专利]固定化漆酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及固定化漆酶的制备方法。

背景技术

日本学者田彦六郎在漆树树液中发现能使“树漆”氧化硬化的酶，后来贝特兰德(G.E.Bertrand，1894)详细地研究了东南亚所产漆中的酶，命名为漆酶。漆酶(Laccases)是借助氧将对苯二酚(氢醌)氧化成对苯醌的酚氧化酶的一种，亦称为对苯二酚氧化酶。漆酶是结合有多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶，分子量约12万，含4原子铜，可被CN-抑制。漆酶存活于空气中，发生反应后唯一的产物就是水，本质上是一种环保型酶。近年来，随着环保意识的逐渐加强，漆酶已成为众多学者的研究对象。

漆酶广泛分布于真菌、植物和昆虫中。在真菌中，漆酶存在于子囊菌纲的脉孢菌(Neurospora)和柄孢壳菌(Podospora)、担子菌纲的多孔菌(Poly-porus)和半知菌类的曲霉菌(Aspergillus)等菌种中。目前发现漆酶也广泛存在于细菌中，如生脂固氮螺菌(Azospirlllum lipoferum)等。不同来源的漆酶其氨基酸序列的相似性并不高，因此漆酶分子量的差异很大。

漆酶可以催化空气中的氧直接氧化分解各种酚类染料、氯酚、取代酚、硫酚、芳香胺、双酚A等，在漆酶介体(HBT、ABTS等)存在下，漆酶还可以催化降解与木质素相关的N-取代对苯基二胺、二苯基甲烷、有机磷化合物(农药)及二恶英等。由于它具有相当广泛的底物专一性和较好的稳定性，因此漆酶在治理含酚废水、纺织印染废水和造纸工业废水以及生物传感器等方面有着巨大的应用前景。

近年来研究发现，漆酶独特的催化特性使其在生物检测中有着广泛的应用，作为高效的生物检测器而成为底物、辅酶、抑制剂等成分分析的有效工具和手段。漆酶构成的生物检测器主要有二种：漆酶电极和漆酶酶标。

酶作为蛋白质，具有蛋白质的普通特性(如：不能重复利用、对变性剂及毒理作用的高度敏感性)，在遇到高温、强酸、强碱时会失去活性，毫无催化功能可言，这些都限制了漆酶的有效使用，提高了使用成本；而较纯净的漆酶价格很高，也限制了漆酶的使用。近年来出现的一种新技术就可部分解决这些问题——固定化酶技术。

固定化酶(immobilized enzyme)是用物理或化学方法处理水溶性的酶，使之成为不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。固定化酶比未固定的酶具有明显的优点：①有一定的机械强度且稳定性好，可做成各种形状(如颗粒状、管状、膜状)装在反应槽中，便于取出，能连续、反复使用，可大大降低生产成本，还可使催化剂与系统分相，便于产物的后期分离。②在使用前可充分洗涤，不带进杂质，对反应影响小。③稳定性提高，不易失去活性，使用寿命延长，可长期使用与储藏，并可以再生。④便于自动化操作，同时也为实现生产的管道化、连续化与自动化提供了可能，便于用电脑控制的连续生产。

通常，酶的固定化方法分为物理方法和化学方法，其中，物理方法主要有吸附法、包埋法和离子吸附法三种。化学方法主要有共价结合法和交联法两种。酶的固定化方法固然很多，但各有其优缺点，总结如下表。

显然，物理吸附法制备容易、酶活力保持高，但是结合力弱；而共价交联法结合力强，酶活力保持适中，但是制备困难。本发明人发现这两种方法具有互补性，使之结合，是固定化漆酶制备的研究方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种固定化漆酶的制备方法，结合物理吸附法和共价交联法，取长补短、优化配合，所制备的固定化漆酶适用于白藜芦醇二聚体的合成，以及在饮料加工中聚合氧化酚类物质，解决果汁澄清缓慢和长时间储存所产生的后浑浊问题。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

一种固定化漆酶的制备方法，采用有多孔烧结玻璃环，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、以CuBr₂为催化剂，2，2’-联吡啶为配体，2-溴丙酸乙酯为自由引发剂，以多孔烧结玻璃环为载体，制备具有甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝聚合功能的多孔烧结玻璃环；

步骤二、在漆酶溶液中，加入具有甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝聚合功能的多孔烧结玻璃环，在30℃条件下震荡或搅拌16～24小时后，加入戊二醛溶液，使戊二醛最终的质量浓度为1％，室温下交联1小时，过滤后纯水洗涤，去除未吸附的游离酶，再离心去除表面水分，即得到吸附交联在多孔烧结玻璃环上的固定化漆酶。

所述漆酶溶液的质量浓度为2～3％的漆酶溶液。

上述技术方案的进一步优化和特点还在于：