[发明专利]HE4单抗、多抗制备及相关诊断试剂盒研制

说明书

技术领域：

本发明涉及HE4的抗体(包括单抗和多抗)的制备、HE4的重组表达及利用HE4的抗体来早期诊断卵巢癌以及卵巢癌复发监测的技术领域。

发明背景：

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，包含了数种不同的组织病理分型，治疗方法取决于具体的肿瘤类型。其中上皮性卵巢癌占了恶性肿瘤的大部分，还包括其它如生殖细胞肿瘤、癌肉瘤(卵巢恶性苗勒氏混合瘤)和卵巢间质肿瘤。上皮性卵巢癌的患者能获得治愈的不到40％，大部分患者初诊时已是晚期。

据WHO近期世界范围统计资料，卵巢癌发病率和死亡率在女性生殖道恶性肿瘤中均仅低于宫颈癌占第二位。在西方国家，卵巢癌死亡率占第一位，甚至比宫颈癌和子宫内膜癌死亡人数的总和还多。由于尚无成熟的早期诊断方法，卵巢癌发现时70％-80％均为晚期，治疗极其困难。常规的手术、化疗难以治愈，即使暂时缓解亦常在2-3年后复发，而对这一部分病人反复手术、化疗严重影响患者生存质量。

NCCN指南反映了分期、分级在判断预后以及在指导治疗上的重要性。卵巢癌主要分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。病理分级仍然是影响预后和治疗的一个很重要因素，这对于早期卵巢癌更为重要，分级有G1、G2、G3。由于卵巢在体内所处的位置，卵巢癌患者早期无典型的临床表现，卵巢癌的早期诊断比较困难，大部分患者确诊时已在晚期，仅有25％的患者在Ⅰ期发现，而Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌患者5年生存率则由Ⅰ期时的95％降至20％～25％，且卵巢癌术后复发率高。肿瘤标志物检测简便且无创，因此其在肿瘤的筛查、诊断、指导治疗、估计预后等方面有着非常广泛的运用前景。

就卵巢癌而言，目前只有癌抗原125(CA125)检测被广泛应用于临床卵巢癌的诊断。CA125是一种高分子糖蛋白，由人类卵巢浆液性囊腺癌细胞给家鼠作免疫接种，通过淋巴细胞杂交而获得，并由单克隆抗体OC125识别而命名。它是目前临床常用的用于卵巢癌诊断的肿瘤标记物，它已成为术后监测卵巢癌治疗效果及有无复发的重要指标。但由于子宫内膜异位症、盆腔炎症等也会导致CA125升高，所以应用CA125诊断卵巢癌并不准确。由于CA125其特异性不强，在早期卵巢癌诊断中敏感性不高，因此，迫切需要一种灵敏性和特异性较强的标志物来提高卵巢癌的诊断水平。一些学者已经进行了CA125与其它血清肿瘤标志物以及超声技术联合应用的研究，多数联合应用的肿瘤标志物包括高分子量糖蛋白类，如CA153、CA724、CA199、脂质结合唾液酸(LAsA)、VOX1等。上述联合应用的方法虽然有可能提高检测的灵敏度，但却是以降低特异性为代价的，所以此方法对于卵巢癌的早期诊断无太大意义。人们仍然致力于寻找新的肿瘤标志物。

人附睾蛋白4(HE4)是一种新的肿瘤标志物，属于乳清酸性4-二硫化中心(WFDC)蛋白家族，此家族中的其它蛋白还包括SLPI，Elafin和PS20(WFDC1)，具有疑似胰蛋白酶抑制剂的特性。HE4基因的cDNA最早由Kirchhoff等从人的附睾中克隆到，该基因编码的蛋白质与细胞外蛋白酶抑制剂有很高的同源性。该基因位于染色体20q12～13.1，全长为12kb左右，由5个外显子和4个内含子组成。该基因存在多种剪切方式，编码分泌小分子蛋白Es7。HE4基因编码一段长度为13kD的蛋白，在其成熟的糖基化形式时，此蛋白大概为20kD～25kD，并且包括一条含有两个WFDC结构域的单链。

HE4首先在附睾远端的上皮中被发现，并且最初认为它是一种与精子成熟相关的蛋白酶抑制剂。一直以来有报道认为HE4在多个正常组织(包括呼吸道和生殖道组织，以及卵巢癌组织)的上皮内均有所表达。不仅在细胞水平上有所表达，分泌型HE4已经在卵巢癌患者的血清中检测到有高水平表达。Hellstrom等比较了卵巢癌患者及正常人血清中的HE4蛋白量，发现大多数卵巢癌患者血清中的HE4蛋白含量有明显提高。在一项关于卵巢癌患者与良性状态下的健康者的病例/对照对比性研究中，Hellstrom等发现HE4检测卵巢癌在特异性水平为96％时具有67％的敏感性。在随后一项对卵巢癌相关的大量生物标志物的评价研究中，HE4检测卵巢癌时具有最高的灵敏度，尤其是在疾病的早期阶段。HE4还可与其它检测项目如CA125联合使用，以提高对恶性肿瘤预测的准确性。

发明内容

发明目的：

本发明的目的是提供一种利用HE4及抗HE4的单抗和多抗作为卵巢癌早期诊断、复发监测简便易得的诊断试剂盒，来测定人血清中HE4的浓度，提高卵巢癌早期诊断的敏感性和特异性，还可用于卵巢癌的复发监测。

技术方案：