[发明专利]纳米金颗粒检测单核苷酸多态性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种纳米技术领域的检测方法，特别是一种利用非对称二维DNA折纸芯片上所构建5nm粒径的纳米金颗粒检测单核苷酸多态性的方法。

背景技术

纳米金(nanogold)是指金的微小颗粒，其直径为1～100nm，一般为分散在水中形成的胶体溶液，故又称胶体金。在纳米金颗粒表面吸附着某种化学物质，单体纳米金颗粒是非常稳定的。金纳米粒子电子密度高，具有量子尺寸效应，小体积效应和表面效应，可以通过静电引力、疏水效应等多种作用形式与大分子结合形成稳定的胶体金探针。在过去40多年来，纳米金颗粒已经被广泛应用于免疫细胞化学以及生物标记等生物技术中。

现有技术的形成是2006年加州理工大学的Rothemund提出、设计、并实现了DNA折纸术[Rothemund PW.Nature 2006，440，297]，Rothemund在最初的文章中折出了六种图形，虽然各具特色，但不难发现它们全部是对称图形；引入分支迁移反应(branch migration)，或称toehold原理，最早是用在构造纳米器件上的，其实就是一个DNA链间的竞争机制：虽然一开始局部可能不按设计配对结合，但经过缓慢降温的热动力学过程，那些整条链都能互补的寡核苷酸链将取代其他部分互补的情况，最终达到完全匹配[Yurke B，Turberfield AJ，Mills Jr AP，etal.Nature 2000，406，605]。另外，前人实验结果所得，toehold长度不同，分支迁移反应的时间就不同(两者成指数关系)[Yurke B，Mills A.Genetic Programming and Evolvable Machines 2003，4，111]。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致，目前，检测单核苷酸多态性的方法包括等位基因特异性杂交法，内切酶酶切技术，引物延伸法，寡核苷酸连接反应等。

公开文献记载了张钊等在先进材料上发表名为空间可寻址免索引的液相非对称DNA折纸芯片文章中公开了DNA折纸芯片订书钉链序列表[Zhao Z，Ying W，et al.Adv  Mater2010，22，1]，该文利用仿中国地图形状的非对称二维DNA折纸术为模板，在模板上设计和引出特定的寡核苷酸序列作为连接位点，通过和修饰了互补序列DNA短链的生物素-亲和素系统杂交结合，把纳米粒子结合到折纸芯片上，同时，还对纳米粒子的结合位置进行了比较。

在对现有技术文献的进一步检索中没有发现：“利用在仿中国地图形状的纳米折纸术结构上连接5nm粒径胶体金作为标记，应用toehold原理”的技术来检测单核苷酸多态性相关文献的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种纳米金颗粒检测单核苷酸多态性的方法。本发明采用现有技术相同的DNA折纸芯片订书钉链序列表，方向是从左到右为5’-3’，但是，本发明中模板上设计结合位点的位置和伸出特定的寡核苷酸序列在制备DNA折纸芯片时，需将带伸出寡核苷酸捕获探针的订书钉链替换列表中相同序列号的订书钉链即可。本发明利用DNA折纸芯片上所构建的纳米金颗粒，利用toehold长度不同，分支迁移反应的时间就不同(两者成指数关系)，从而检测单核苷酸多态性。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明包括如下步骤：

第一步，利用DNA折纸术构造一个非对称二维图形，制备DNA折纸芯片；

所述的非对称二维图形是依靠M13mp18噬菌体的单链DNA，长达7249个碱基脚手架长链光栅填充式的反复折叠形成的，而图形则来自用于绑定的229条短订书钉链。

所述的DNA折纸芯片的制备方法：

(1)把所有要用的100μM订书钉链，包括形成非对称二维图形的、伸出探针的等体积混合，再稀释20倍备用；

(2)在96孔板上混合总量为30μl的溶液：0.025μM订书钉链：22μl；1/2浓度的M13mp18：1μl；1×TAE-Mg2+buffer：7μl。

第二步，制备胶体金探针；

所述的胶体金探针制备方法：

①寡核苷酸与5nm粒径胶体金摩尔浓度比200比1加入10mM磷酸缓冲液中，室温300rpm摇24小时。