[发明专利]一种长效重组人干扰素及其重组表达工程菌的构建、表达和纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种长效重组人干扰素及其表达纯化方法、重组表达工程菌的构建，具体讲，涉及一种经过点突变的长效重组人干扰素，以及其表达纯化方法和重组表达工程菌的构建。

背景技术

根据干扰素(interferons，IFNs)的定义，干扰素是一类至少在同种细胞上具有广谱抗病毒、抗细胞分裂、免疫调节活性和在不同途径上影响细胞的代谢、生长和分化的蛋白质，其活性的发挥需新合成RNA和蛋白质，它是一类重要的细胞因子。经过近半个世纪的基础和临床研究，说明它是一种重要的广谱抗病毒、抗肿瘤治疗药物。

干扰素首先与特异性细胞受体结合，通过信号传递，激活细胞基因表达，从而发挥干扰素的生物学活性：

1.抗病毒活性：抑制病毒基因的复制。

2.抗细胞增殖活性：细胞膜的改变；细胞骨架的改变；刺激细胞分化；调节生长因子的表达；抑制癌基因的表达；逆转恶化细胞的表型；激活p53基因的表达。

3.免疫调节活性：诱导其它细胞素的表达；激活巨噬细胞、NK细胞；上调HLA I和II的表达；调节肿瘤相关抗原的表达。

迄今所知，人干扰素存在多个型别：干扰素-a，b，d，g，e，k，l，t，w，limitin等型别，它们的主要特点和可能的临床应用各异。

目前，研究较多并用于临床治疗的有a、b、g，其它型别干扰素是否有临床应用价值尚在研究之中。

干扰素-a，属I型干扰素，约有23个变种，较详细研究的有约13种亚型。分子量为19-26kDa，由156-166个氨基酸组成，115-151之间为保守序列。基因集中在9p22，受体基因位于21q22.1。世界上批准用于治疗病毒病和恶性肿瘤的主要干扰素-a有：干扰素-a1b、a2b、a2a.，治疗约40种适应症，包括我国将干扰素-a2b列为预防SARS的储备药物之一。

干扰素在机体内的清除速率在人和动物都研究得比较详细，动物实验的资料与人体试验大致上相似。干扰素的活性有相对的种属特异性，但是干扰素的药物动力学，不同动物获得的结果却无明显的差别。

干扰素是一种蛋白质，口服以后一般为蛋白酶类所破坏。Schafer等(1972)证明，新生的小白鼠口服外源性鼠干扰素之后，在血流中可以发现干扰素，并且可以抵抗VSV的攻击。新生小鼠口服兔干扰素，也可以在血流中测出兔干扰素的存在。说明血流中存在的干扰素并非由于干扰素制剂中混有其他物质而诱生的小白鼠干扰素，而确是口服后进入血流的。8日龄小白鼠也获得同样结果。但是，成熟小白鼠口服干扰素后，在血流中不能发现干扰素。这些结果为新生儿口服干扰素防治新生儿病毒性疾病提供了基础。Emisphere公司的Eligen技术正在研究将人生长因子(与干扰素的大小相似)口服的研究。

据Merigan(1975)报告，志愿者鼻腔接种干扰素后，在呼吸道可以维持17小时左右。Harmon等(1976)证明不少正常人的鼻分泌液中含有一种人成纤维细胞干扰素的抑制剂，但是这一抑制剂对白细胞干扰素无作用。Johnson等(1976)用10只猩猩和3名志愿者做的试验表明，在鼻腔局部应用人白细胞干扰素后(10000单位/0.01毫升滴鼻前庭)，除个别外都能保存，但是1小时后减少了5～50倍，说明局部应用的干扰素可被局部的黏液流所清除。

小白鼠干扰素静脉注射小白鼠后，血流中的干扰素浓度很快下降，1小时仅为原始剂量的1/30，半衰期为11分钟(Baron et al 1966)；或1小时仅为原始剂量的1/16，半衰期为19分钟(Finter 1966)。Gresser et al(1967)静脉注射小白鼠128000单位干扰素，1分钟后血清中保存3840单位/毫升，1小时后仅80单位/毫升，半衰期为7分钟。Ho等(1967)给1公斤重家兔静脉注射100000单位干扰素，在11分钟之内血流干扰素就下降一半。Bocci等(1967)于700克家兔静脉注射17500单位干扰素，发现其半衰期仅2～4分钟。静脉注射后干扰素的清除速度与注射量有关，注射3×10⁵单位干扰素时6小时消失，注射3×10⁶单位，12小时消失；注射3×10⁷单位，36小时消失。干扰素制品的纯度对静脉注射干扰素的清除无影响(Cantell et al 1976)。