[发明专利]一种长效重组人干扰素及其重组表达工程菌的构建、表达和纯化方法

权利要求书

1.一种长效重组人干扰素，其特征在于，所述的长效重组人干扰素具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的任一氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1所述的长效重组人干扰素的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列以长效重组人干扰素-α2 b为模板，针对编码第50位赖氨酸和126位精氨酸的核苷酸设计引物，

将编码第50位赖氨酸的核苷酸突变为编码组氨酸的核苷酸，构建SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；

将编码126位精氨酸的核苷酸突变为编码组氨酸的核苷酸，构建SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或

将编码第50位赖氨酸的核苷酸突变为编码组氨酸的核苷酸，并将编码126位精氨酸的核苷酸突变为编码组氨酸的核苷酸，构建SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于，

所述的针对将编码第50位赖氨酸的核苷酸突变为编码组氨酸的核苷酸的引物序列如SEQID NO：7、SEQ ID NO：8所示；

所述的针对编码126位精氨酸的核苷酸突变为编码组氨酸的核苷酸的引物序列如SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10所示。

6.一种重组表达工程菌，其特征在于，所述的重组表达工程菌中含有权利要求3所述的核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的重组表达工程菌，其特征在于，所述重组表达工程菌的构建方法为，将目的基因片段经过点突变，得到重组表达载体pBV220/rhuIFNa2b，将重组表达载体pBV220/rhuIFNa2b转化进入大肠杆菌DH5a，构建得到重组表达工程菌pBV220/rhuIFNa2b/DH5a。

8.根据权利要求6所述的重组表达工程菌，其特征在于，所述重组表达工程菌的培养方法为：挑取阳性重组表达工程菌单菌落，接种于培养基中，37℃活化过夜后稀释，于30℃，220～240转/分振摇培养至对数生长期，再于42℃，220～240转/分振摇诱导培养3～5小时。

9.根据权利要求1所述的长效重组人干扰素，其特征在于，所述长效重组人干扰素表达后的纯化步骤包括：

①收集表达后的菌体，以每克用10ml的预冷TE溶液悬浮、洗涤菌体，离心，取沉淀，重复1～2次；

②取步骤1得到的沉淀按每克加5ml预冷TE溶液，混匀后每50ml加入1mg溶菌酶，混匀，2～8℃反应2～6小时；

③将溶菌酶作用后的菌液超声处理后，再加入4倍体积预冷的TE溶液，15000转，2～8℃离心20～30分钟，收集沉淀；

④将沉淀按重量比1∶10悬浮于预冷4M尿素溶液中，15000转，2～8℃离心20～30分钟，收取沉淀，重复操作一次；

⑤将沉淀按重量比1∶15悬浮于预冷的TRIS液体中，15000转，2～8℃离心20～30分钟，收取沉淀，重复操作一次；

⑥包涵体裂解：按沉淀重量比1∶5加入预冷8M盐酸胍溶液，搅匀，室温裂解1～3小时，15000转，2～8℃离心1～2小时，收上清；

⑦复性：将上清加到2.5M盐酸胍溶液中稀释，然后再加入到Ph值为9.5的硼酸-氢氧化钠缓冲液中稀释，于2～8℃过夜；

⑧浓缩：将稀释后的蛋白复性液分装入透析袋中，进行浓缩。

10.根据权利要求1所述的长效重组人干扰素在制备治疗肿瘤及病毒感染性疾病药物中的应用。

11.根据权利要求10所述的长效重组人干扰素应用，其特征在于，所述的长效重组人干扰素作为所述药物的活性成分，制备生理上可接受的各种液体试剂或冻干试剂。