[发明专利]粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂及制备方法

权利要求书

1.一种粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂的制备方法，其特征在于：制备步骤包括：菌种的取得、一级斜面菌种培养、液体种子培养、液体发酵罐生产和无纺布菌条的接种培养；

具体制备步骤包括：

A、菌种的取得:

AsG0910菌株，其保藏号为CGMCC No.3523，分离自柑桔粉虱的粉虱座壳孢（Aschersonia  aleyrodis）；

B、一级斜面菌种培养:

 将分离纯化的菌种接种于PDA培养基斜面，放入25℃培养箱，培养20-22天，待菌丝长满斜面并产孢时，转入摇瓶进行液体种子培养；

C、液体种子培养:

 在500m1三角瓶中，装入200ml的液体种子培养基，1.5 pa/kg高压灭菌30min，待冷却至40±1℃，在超净工作台内，从斜面菌种子刮取2支培养好的一级斜面菌种的孢子粉到无菌的体积浓度为0.01%的Tween80水溶液中，刮取试管的规格为180mm×15mm，利用高速分散器使孢子分散均匀，然后将该菌悬浮液接液体培养基中，置于恒温振荡培养箱，24-26℃, 160转/分，培养22天即可；

D、液体发酵生产:采用三级发酵；

(1)、一级种子罐生产

 取50L气升式发酵罐，装入35 L液体培养基，温度95℃-100℃，并加入消泡剂 10.5m1，在0.15MPa压力下，保压25-40min，消毒冷却后将4瓶步骤（3）培养好的500m1摇瓶种子接入培养，24-26℃，通气量l∶0.5 V/V·min，保压0.05-0.07MPa，经144-168 hr通气培养，达到对数生长期后，接入二级种子罐；

 (2)、二级种子罐生产

 取100L气升式发酵罐，装入70L液体培养基，温度95℃-100℃，并加入消泡剂 18m1，在0.15MPa压力下；

保压25-40min，消毒冷却后将一级种子罐种子35L全部接入二级种子罐培养，温度24-26℃，通气量1:0.5 V/V·min，保压0.05-0.07MPa，经144-168 hr通气培养，达到对数生长期后，接入三级种子罐；

 (3)、三级种子罐生产

 取1T气升式发酵罐，装入700L液体培养基液体，pH 6.0-7.0，加入的热水温度95℃-100℃，并加入消泡剂 210m1，通入蒸汽加热到121 ℃，保压30min，冷却至24-26 ℃，将二级种子罐培养好的液体种子70 L全部接入，通气培养，通气量1:0.4-0.5V/V.min，搅拌转速150r/m,罐压0.05-0.07MPa，培养时间312-336 hr；  

当发酵液中出现大量菌丝及液生孢子时，残糖在1%以下，发酵液较粘稠，另外镜检菌丝变细、菌丝体中无明显的液泡，发酵液中无明显断裂的菌丝，可放罐；

 E、将黄色无纺布条在1.5Pa/Kg高压灭菌30min后，冷却后按700条无纺布条接入100L发酵液的比例浸入已培养好的发酵液，在20-28℃，湿度为RH93%的培养室架上平铺培养5天，待菌条上长满菌丝后，移入温度在20-28℃，湿度为RH90%的培养室继续培养5-7天，菌条上长满大量孢子，风干即可。

2.根据权利要求1所述的粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂的制备方法，其特征在于：所述的斜面培养基液包括: 去皮马铃薯200g，蛋白胨10g,葡萄糖40g,琼脂20g，水l000ml。

3.根据权利要求1所述的粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂的制备方法，其特征在于：所述的液体种子培养基包括:在1000m1培养基中含10g蛋白胨、10g酵母浸膏、10g NaCl，各组分混合后加水补至1000m1，并用饱和NaOH水溶液调pH至7.0。

4.根据权利要求1所述的粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂的制备方法，其特征在于：所述的气升式发酵罐中的液体培养基包括：在1000m1培养基中含5g蛋白胨、10g酵母粉、10g NaCl，加麸皮煮汁，即在800 ml水中加麸皮60g煮30min，一层纱布过滤，去除残渣，各组分混合后加水补至1000m1，并用饱和NaOH水溶液调pH至7.0。