[发明专利]一种显示细胞增殖活性的靶向细胞染色试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种显示细胞增殖活性的试剂盒及其使用方法，具体地涉及一种显示脱落细胞如宫颈脱落细胞、食管刷片细胞等抹片上细胞酸性磷酸酶的方法及试剂盒。 

背景技术

从上世纪中叶开始，巴氏抹片和染色技术被逐步推广成为一种子宫颈癌的筛选方法。在获得推广的国家中可以发现，应用这种方法后大大减少了子宫颈癌的死亡率和发病率。在美国每年有超过5000万例行抹片筛查，其中有350万(7％)检出有阳性/异常。然而，每年仍然有4500人死亡和13000例新的子宫颈癌病例1。研究表明，20％的新癌症病例在美国用巴氏染色从未检出过阳性，在疾病发作前有3到5年时间巴氏染色结果为阴性。尽管巴氏染色法是最成功、最有效的癌症筛查法，但是它的缺陷导致了很高的假阴性率。尽管最近对巴氏技术进行了一定的改善，如引进液基细胞自动化涂片技术，人乳头状瘤病毒检测，以及更多的如免疫细胞化学方法，但此问题仍然存在。是否有替代巴氏染色法的技术呢？在1959年至1980年，一些在医学文献中提到了在子宫颈癌细胞内有醋氯酸酯酶、B-葡萄糖醛酸酶、酸性磷酸酶的活性，并且用了患有宫颈癌和子宫癌妇女的阴道分泌物及冰冻切片组织化学来证明。不幸的是，此结果后来没有任何进展，直到1997年Markovics提出一个想法，在检测宫颈不典型增生的子宫颈抹片检查中这些酶是否可以发挥更加重要的作用，亦即能否减少假阴性的判读率。 

1998年，Markovics发表了关于宫颈脱落上皮酸性磷酸酶检测的结果和进展，并研究出了一个新的CAP-PAP染色法。该方法能将巴氏染色结果中的异常子宫颈细胞内的酸性磷酸酶明显着色，可作为天然的子宫颈鳞状细胞异型增生的生物标记物。2003年，Markovic发表了1000例宫颈细胞染色的结果，测试了CAP-PAP的灵敏度为81％，特异性为97％，与传统巴氏染色相比较显著地提高了阳性检出率(p＜0.05)。由此得出结论是：CAP染色的能增加巴氏染色的敏感性，使细胞检验员筛查标本时能显著提高检阳性/异常标本检出率和减少假阴性率(Markovic O，Markovic N，et al.Cervical acid phosphatase：A new biomarker ofcervical dysplasia.Arch Oncol 2003；11：243-247) 

然而，该操作方法在应用上有以下几个不足之处：1、酶孵育液配制过程繁杂，表现在(1)偶氮盐要临时用亚硝酸钠配制，需要在含有的46ml和2.5ml醋酸的烧瓶内预温反应3分 钟，既费时又费力。(2)、每次配制各种试剂需要加入10滴试剂，这样在实际使用时容易发生错误。2、孵育时间较长，需要45分钟。3、需巴氏染色复染，增加了操作步骤且影响到酶反应产物的观察。4、染色全程时间过长，全程需要60分钟以上。5、应用范围窄，仅用于宫颈细胞。5、试剂盒材料及包装成本较高。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种显示细胞增殖活性的靶向细胞染色方法，本发明的方法改良了CAP-PAP染色法的配方和操作技术，使之能更方便和廉价地运用于液基细胞沉降法制片染色中。 

本发明提供的技术方案如下： 

本发明提供的一种显示细胞增殖活性的试剂盒，包括两种类型，其中： 

试剂盒I，包括： 

(1)、试剂A-酶底物1，含固酱紫0.25-1％； 

(2)、试剂B-酶底物2  含AS-TR磷酸酯0.5-2％； 

(3)、试剂C：0.05～0.20M醋酸缓冲液，PH5.0～5.5 

(4)、试剂D-酶固定液：含柠檬酸0.5g～1.0g，蒸馏水25.0～35.0ml，甲醇5.0～15.0ml，丙酮50.0～70.0ml，氯化镁0.05-0.1g； 

(5)、磷酸盐缓冲液：0.005～0.02M，PH 8.0～PH8.5； 

(6)、Mayer苏木素。 

试剂盒II，包括： 

(1)、试剂A-酶试纸：试纸含有酸性磷酸酶底物AS-TR磷酸酯和显色剂固酱紫成分； 

(2)、试剂B-醋酸盐缓冲液；含10～50％PVP的0.05～0.20mol/L、醋酸盐溶液，PH5.0～5.5； 

(3)、试剂C-酶固定液：含柠檬酸0.5～1.0g，蒸馏水25.0～35.0ml，甲醇5.0～15.0ml，丙酮50.0～70.0ml，氯化镁0.05-0.1g； 

(4)、试剂D-缓冲液；0.005～0.02M，PH 8.0～PH8.5；