[发明专利]小分子RNA标签

说明书

技术领域

本发明涉及核酸测序技术领域，特别是小分子RNA测序技术领域。另外，本发明还涉及基于通过PCR引入分子标签的技术，以及小分子RNA文库制备方法。本发明的方法特别适用于第二代测序技术，尤其是solexa测序技术。

背景技术

小分子RNA(small RNA)是生物体内一类重要的特殊分子，诱导基因沉默，参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。基于solexa高通量测序技术的小RNA数字化分析，采用边合成边测序(SBS-sequencing by synthesis)，可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。并具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点，一次性获得数百万条小分子RNA序列，能够快速全面地鉴定该物种在该状态下的小分子RNA和发现新的小分子RNA，构建样品之间的小分子RNA差异表达谱，为小分子RNA功能研究提供有力工具。

目前illumina公司的Solexa测序平台提供的小分子RNA文库制备方法有两种，分别为方法一(Preparing Samples for analysis of smallRNA)和方法二(Preparing Samples for Small RNA Sequencing Usingthe Alternative v1.5Protocol)。方法一，从总RNA中首先分离长度为18～30nt的小分子RNA，然后将分离的小分子RNA分别依次与5’接头(也称为adapter)、3’接头连接，每次连接完接头后都需要切胶回收连接的目的片段，随后将带有已知接头的目的片段进行逆转录反应，通过PCR反应扩增带有接头的目的片段，最后切胶回收带有接头的目的片段文库[1]，如图1(a)；方法二，从总RNA中首先分离长度为18～30nt的小分子RNA，然后将分离的小分子RNA依次与3’接头、5’接头连接，其中方法二的接头连接顺序与方法一不同，且3’接头与方法一的3’接头序列的5’末端位点修饰不同，此外方法二中，连接完接头后不需要切胶回收目的片段，随后将带有已知接头的目的片段进行逆转录反应，通过PCR反应扩增带有接头的目的片段，最后切胶回收含有目的片段文库[2]，如图1(b)。

方法一使用T4RNA连接酶1来将目的片段分别和5’接头、3’接头发生连接反应，其中T4RNA连接酶1在含有ATP的10×T4RNA连接酶1缓冲液反应体系中，20℃连接6小时。该方法的缺点是费时费力，每次将目的片段与接头连接反应后需要通过PAGE电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳)来选择纯化回收的目的片段，在操作过程中也较容易造成RNA的降解。

方法二将3’接头的5’末端进行预腺苷酰化处理，使用T4RNA连接酶2截短型(T4RNL2truncated)将目的片段与3’接头进行连接反应，该酶可特异性地将DNA或RNA的预腺苷酰化5’末端连接到RNA 3’末端。连接时不需要ATP，但需要预腺苷酰化底物。与全长的T4RNA连接酶2不同，T4RNL2截短型酶不能将底物的5’末端腺苷酰化，因此无法将RNA或DNA的5’磷酸末端连接到RNA3’端[3-5]。

综上所述，方法一与方法二的最大区别在于，方法二在连接3’接头使用的连接酶为T4RNA连接酶2截短型，而方法一使用的是T4RNA连接酶1。由于T4RNA连接酶2截短型可以特异识别预腺苷酰化的修饰位点，所以将3’接头的5’端的碱基进行预腺苷酰化修饰，该连接酶特异识别该位点后进行正确的连接反应。此外该连接酶还大大缩短了连接反应的时间，而且连接3’接头后不需要切胶选择目的片段分子，便可直接与5’接头进行连接，连接5’接头后也不需要切胶选择目的片段分子，可直接进行RT-PCR反应，所以方法二相对方法一更省时省力。

方法一和方法二这两种文库制备的方法只能对单个文库样品进行Solexa Single End测序，不能将Solexa小分子RNA文库样品混合测序。因为随着solexa测序通量的增加，1个测序泳道(lane)所产出的数据远远大于目的片段所需求的数据量，如果所构建的文库样品不能进行混合测序，将在一定程度上“浪费测序资源”和影响到测序通量。

因此，现在需要一种利用Solexa测序的高通量，而能将小分子RNA文库样品混合进行测序的方法，从而提高小分子RNA测序的效率和通量。

发明内容