[发明专利]小分子RNA标签

权利要求书

1.一组标签，其中所述一组标签包括如下或由如下组成：表1所示16个标签或与之相差1个碱基的标签中的至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，至少6个，或至少7个，或至少8个，或至少9个，或10个，或至少11个，或至少12个，或至少13个，或至少14个，或至少15个，或全部16个，

所述一组标签优选地至少包括表1所示的16个标签中的Index1和Index2，或Index3和Index4，或Index5和Index6，或Index7和Index8，或Index9和Index10，或Index11和Index12，或Index13和Index14，或Index15和Index16，或者他们任何两个或多个的组合。

2.权利要求1所述的标签，其中所述相差1个碱基包括标签中1个碱基的取代、添加和删除。

3.权利要求1或2所述的标签用于小分子RNA文库构建并测序的用途，其中所述标签包含在用于扩增目的序列的PCR引物中，从而构成各自相对应的标签PCR引物。

4.权利要求3所述的用途，其中所述标签嵌入用于扩增目的序列的PCR引物中，或者通过或不通过连接子与用于扩增目的序列的PCR引物的5’端或3’端相连，优选地是不通过连接子与用于扩增目的序列的PCR引物的5’端相连，从而构成各自相对应的标签PCR引物。

5.使用权利要求1或2所述的标签构建的小分子RNA文库。

6.权利要求1或2所述的标签所对应的一组标签PCR引物，其包含权利要求1或2所述的标签，所述一组标签PCR引物包括如下或由如下组成：表2所示16个标签PCR引物或与其中包含的标签序列相差1个碱基的标签PCR引物中的至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，至少6个，或至少7个，或至少8个，或至少9个，或10个，或至少11个，或至少12个，或至少13个，或至少14个，或至少15个，或全部16个，

所述一组标签PCR引物优选地至少包括表2所示的16个标签中的Index1_PCR_2.0和Index2_PCR_2.0，或Index3_PCR_2.0和Index4_PCR_2.0，或Index5_PCR_2.0和Index6_PCR_2.0，或Index7_PCR_2.0和Index8_PCR_2.0，或Index9_PCR_2.0和Index10_PCR_2.0，或Index11_PCR_2.0和Index12_PCR_2.0，或Index13_PCR_2.0和Index14_PCR_2.0，或Index15_PCR_2.0和Index16_PCR_2.0或者他们任何两个或多个的组合。

7.权利要求6所述的标签PCR引物，其中所述相差1个碱基包括标签中1个碱基的取代、添加和删除。

8.使用权利要求6或7所述的标签PCR引物构建的小分子RNA文库。

9.权利要求6或7所述的标签PCR引物用于小分子RNA文库构建并测序的用途。

10.一种用于小分子RNA文库的构建并测序方法，其包括：

1)提供n个总RNA样品并回收18～30nt的小RNA，n为整数，且1≤n≤16，优选地2≤n≤16，所述样品包括但不限于来自植物如水稻、拟南芥和动物如小鼠、人，所述的回收可以通过例如电泳，特别是变性PAGE电泳；

2)添加接头：在适合于连接接头的条件下，将分离的小分子RNA分别与5’接头、3’接头连接，连接顺序可以是先5’接头后3’接头，也可以是先3’接头后5’接头；

3)构建文库：随后将带有接头的目的片段进行逆转录反应，通过PCR反应扩增带有接头的目的片段，其中对于每一个样品，使用一个标签PCR引物，所述标签PCR引物是含有如权利要求1所述的标签的标签PCR引物，特别是如权利要求3中所述的标签PCR引物，最后切胶回收带有接头的目的片段，所述片段优选的是约100bp；

4)混合：当n＞1时，将各样品的PCR扩增产物混合在一起；当n＝1时，直接进行步骤5)；

5)测序：将各样品的PCR扩增产物的混合物利用测序技术，优选地是Solexa测序技术进行测序，其中需要小分子RNA测序引物和小分子RNA标签测序引物分别对目的片段和标签进行测序。