[发明专利]一种快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种试剂盒，特别涉及采用LAMP方法快速检测卫氏并殖吸虫成虫、囊蚴、虫卵的技术，具体来说是一种快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒和方法。

背景技术

卫氏并殖吸虫，是人体并殖吸虫的重要虫种之一，是引起肺型并殖吸虫病为主的并殖吸虫。卫氏并殖吸虫的致病，主要是童虫或成虫在人体组织与器官内移行、寄居造成的机械性损伤，及其代谢物等引起的免疫病理反应。根据病变过程可分为急性期及慢性期。它潜伏期不易确定，感染后急性发病。症状随虫体寄生的部位不同而异。以胸、腹、脑损害的表现为多见。卫氏并殖吸虫的终宿主除人外，主要为肉食哺乳动物如犬、猫。第一中间宿主为生活于淡水的川卷螺类。第二中间宿主为淡水蟹和蜊蛄。生活史过程包括卵、毛蚴、胞蚴、母雷蚴、子雷蚴、尾蚴、囊蚴(脱囊后称后尾蚴)、童虫及成虫等阶段。成虫主要寄生于肺，所形成的虫囊往往与支气管相通，虫卵经气管随痰或吞入后随粪便排出。卵入水后，在适宜条件下约经3周左右发育成熟并孵出毛蚴。毛蚴在水中活动，如遇川卷螺，则侵入并发育，经过胞蚴、母雷蚴、子雷蚴的发育和无性增殖阶段，最后形成许多具有小球形尾的短尾蚴。成熟的尾蚴从螺体逸出后，侵入淡水蟹或蜊蛄，或随螺体一起被吞食而进入第二中间宿主体内。在蟹和蜊蛄肌肉、内脏或腮上形成球形或近球形囊蚴。囊蚴直径约300-400μm，具两层囊壁。人吃了含有囊蚴的淡水蟹或蜊蛄而感染。该病的诊断主要采用病原学检查痰或粪便中的虫卵，以及免疫学实验，但以上技术操作起来需要PCR仪等比较昂贵的仪器，所以在大批量样本检测和虫卵及囊蚴样本分型时比较费时费力。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等在2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。

鉴于以上原因，环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)这种高效，方便快捷的检测技术可用于卫氏并殖吸虫的鉴定，进而可为卫氏并殖吸虫病的快速检测和防控等提供有效的检测手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒和方法，所述的这种快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒和方法要解决现有技术中检测卫氏并殖吸虫成虫、囊蚴、虫卵的方法复杂，又费时又费力的技术问题。

本发明提供了一种快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒，包括DNA裂解液、LAMP反应液、SYBR green I显色液和卫氏并殖吸虫DNA阳性对照液。

进一步的，还包括Bst大片段聚合酶。

进一步的，所述的DNA裂解液由细胞裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液四个试剂配制而成，配制好后，在所述的DNA裂解液中，所述的细胞裂解液的终浓度为7-10μM，所述的EDTA的终浓度为0.5M，所述的蛋白酶K的终浓度为18-20mM，所述的RNase A溶液的终浓度为3-5μM。

进一步的，所述的LAMP反应液由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、甜菜碱、引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、环引物Loop F、环引物LoopB和MgSO₄溶液十二个试剂配制组成，所述的引物FIP的序列如SEQ ID No：1所示，所述的引物BIP的序列如SEQ ID No：2所示，所述的引物F3的序列如SEQ ID No：3所示，所述的引物B3的序列如SEQID No：4所示，所述的环引物LoopF的序列如SEQ ID No：5所示，所述的环引物LoopB的序列如SEQ ID No：6所示，配制好后，所述的dATP、dTTP、dGTP、dCTP的终浓度均为200μM，引物FIP、BIP、F3、B3的终浓度均为0.2mM，环引物Loop F、LoopB的终浓度均为0.8μM，甜菜碱的终浓度为10μM，MgSO₄的终浓度为10mM。

进一步的，所述的SYBR green I显色液为1∶10倍稀释液。

进一步的，卫氏并殖吸虫DNA阳性对照液的浓度为32.0-45.0ng/μL。

进一步的，所述的Bst大片段聚合酶的浓度为8U/μL。

本发明还提供了一种快速检测卫氏并殖吸虫的方法，包括如下步骤：

(1)对被检测的成虫、囊蚴、虫卵的DNA进行提取；