[发明专利]诱导花生不定芽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种组织培养诱导花生丛生芽的方法，特别是涉及一种高效诱导花生不定芽的方法，属于生物技术领域。

背景技术：

花生是一种重要的油料作物和经济作物，在我国种植面积较大。提高花生的产量、质量，离不开优良品种，花生组织培养是利用生物技术进行花生育种的一个重要环节。

目前，有些作物建立起了高效的植株再生体系，筛选出高诱导率基因型（如水稻的日本晴，中华11），但大多数作物的植株再生率仍很低（1%-30%），成为限制基因工程技术应用的瓶颈。目前花生丛生芽诱导率报道的平均不超过50%，且稳定性和重复性差。花生高效再生体系的建立是花生基因转化的基础。植株再生受基因型影响很大，同时也和外植体类型及培养基配方有关。细胞分裂素在组织培养诱导芽再生中比较有效，BA和TDZ在多种作

发明内容：

本发明要解决的技术问题：提供一种诱导率高、稳定性高、重复性好的组织培养诱导花生不定芽的方法。

本发明的技术方案：

一种诱导花生不定芽的方法，包括如下步骤：

（1）种子预培养　选取成熟的豫花1号花生种子，先用70%乙醇浸润20-30s，然后用0.1%的HgCl₂溶液消毒8-10min，用无菌水冲洗5~6次，然后在无菌水中浸泡2~3h，将花生种皮去掉，再去掉一片子叶，将剩下带有胚芽的另一半子叶接种于不添加激素的MS培养基中培养，培养温度25~26℃，光照时间12-14h/d，光照强度1000-2000 lx，培养4天；

（2）外植体制备　将培养后的花生子叶掰掉，夹紧胚轴，用无菌刀片将花生幼叶从基部切下，将幼叶横切，平均分成三份，或从近叶柄1/3处一分为二，得到外植体；

（3）诱导和分化　将外植体接种在诱导培养基中培养，培养温度为25~26℃、光照时间12-14h/d，光照强度1000-2000 lx，培养7-8天后外植体边缘出现绿色芽点，转到继代培养基中，再培养18-22天获得诱导芽。

所述诱导培养基为：MS +BA 3 mg/L +NAA 0.4 - 0.8 mg/L +TDZ 0.1 - 0.3 mg/L +AgNO₃ 3.5 mg/L。

所述继代培养基为MS +BA 5 mg/L +NAA 1mg/L +AgNO₃ 3.5 mg/L。

本发明的有益效果：  

（1）本发明通过严格筛选，选出基因型豫花1号作为外植体，经过种子预培养、外植体制备和诱导、分化等环节，得到花生不定芽，比目前文献报道的花生丛生芽的诱导率高，经多次接种试验证明，诱导率结果稳定，重复性较好。

（2）本发明优化了芽诱导培养基配方，使外植体萌发不定芽的时间大大提前，萌发时间从原来的14天左右，提前到7-8天。

（3）本发明方法可获得稳定的高诱导率，豫花1号在三种不同的培养基上培养（MS +BA 3 mg/L +NAA 0.4 mg/L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO₃ 3.5 mg/L；MS +BA 3 mg/L +NAA 0.8 mg/L +TDZ 0.1 mg/L +AgNO₃ 3.5 mg/L；MS +BA 3 mg/L +NAA0.8 mg/L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO₃ 3.5 mg/L），芽诱导率稳定在90%以上，分别为91.6~92.5%、97.5~98.5%、99.5~100%。

而同样条件下开农49、开农30、豫花15号在MS +BA 3 mg/L +NAA0.8 mg/L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO₃ 3.5 mg/L培养基上培养，其不定芽诱导率分别为51.2~52.6%、31.8~33.5%、36.8~38.5%。可看出，豫花1号作为外植体时的不定芽诱导率比其他品种优势明显。

附图说明：      

图1：豫花1号外植体在MS +BA 3 mg/L +NAA0.8 mg/L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO₃ 3.5 mg/L培养基上诱导不定芽情况。图中外植体切口边缘的绿色突起为诱导产生的不定芽。