[发明专利]一株短小芽孢杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一株短小芽孢杆菌以及使用该菌株将酒精转化为有机酸的方法。

背景技术

有机酸是成品醋中的重要成分，其组成非常丰富，它不仅决定了食醋的酸味质量，还是决定成品醋缓冲性和pH的重要物质之一，同时它还影响产品的货架期和生物安全性。尽管食醋中酸含量很高，但并无刺激感，酸味很柔和，这其中有机酸的作用是非常重要的。

目前发现用于食醋酿造过程的微生物主要有：乳酸菌(Lactic acid bacteria)、乳杆菌(Lactobacillus)、醋酸菌(Acetic acid bacteria)、酵母菌(Saccharomycete)、曲霉菌(Aspergillus)。但未见报道采用本发明所述短小芽孢杆菌用于食醋的酿造。本发明从镇江香醋醋醅中分离出一株产酸的短小芽孢杆菌，液态发酵显示该株芽孢杆菌可以产生多种有机酸，并且对醋的风味具有一定作用。

发明内容

本发明提供了一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，该菌株筛选自镇江香醋醋醅中，于2010年5月11日保藏于中国普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 3824。

获取所述菌株16S rDNA序列，在GenBank中进行BLAST比对确定其种属，该菌株16SrDNA全长序列为1495bp，与其具有最高同源性的菌株为Bacillus pumilus(GenBank登录号EU373381)，相似性为99％；16S rDNA序列见SEQ ID NO：1。

所述菌株可利用乙醇发酵生产乙酸、琥珀酸、苹果酸和乳酸组成的有机酸。

所述发酵生产有机酸的工艺为：

种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0，115℃下灭菌20min；

液态发酵培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5-10g/L，氯化钠5-10g/L，pH7.0，115℃下灭菌20min；待培养基冷却至室温，加入6％(w/w)无水乙醇；

种子培养方法：250mL三角瓶装液量25mL，摇床转速120rpm，37℃培养；

发酵培养方法：以5-10％的接种量将种子接入发酵培养基，250mL三角瓶装液量25mL，摇床转速120rpm，37℃培养。

本发明还提供了一种所述菌株的应用，采用上述发酵生产有机酸的工艺，该菌株发酵生产的乙酸、琥珀酸、苹果酸和乳酸组成的有机酸可应用于食品领域。

本发明还提供了一种所述菌株的应用，在酿醋过程中加入所述短小芽孢杆菌，可提高原料的利用率以及改善醋的风味。

本发明从醋醅中筛选得到一株具有较好有机酸生产能力的菌株，经鉴定为短小芽孢杆菌。该菌株可产生乙酸、琥珀酸、苹果酸和乳酸组成的有机酸，其有机酸总量达到6.25g/L，在酿醋过程中添加该菌株，可提高原料的利用率以及改善食醋的风味。

具体实施方式

实施例1：产酸芽孢杆菌的筛选

从镇江香醋醋醅中取10g样品装入混有玻璃珠和90mL无菌水的500mL三角瓶中，在37℃摇床上以115r/m振荡30min，然后取菌悬液1mL用无菌生理盐水10倍梯度稀释，以10^-3和10^-4梯度稀释样涂布GYC平板，37℃培养48～72h；根据其在GYC平板上有无透明圈来判断是否是产酸菌，然后挑取透明圈明显、菌落丰厚的菌落经分离纯化后接入斜面培养基，37℃培养48h，4℃保藏。

分离培养基(GYC)：酵母粉1％，葡萄糖1％，碳酸钙0.5％，琼脂2％，115℃灭菌20min后冷却至50℃加入无水乙醇6％(v/v)。

斜面培养基(肉汤)：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，牛肉膏1％，NaCl 0.3％，琼脂2％，pH7.0-7.2，115℃灭菌20min。

根据分离培养基中透明圈大小挑取菌株，并且在添加乙醇的液体培养基上验证有机酸产量，并结合其在平板上的菌落形态，得到4株高产有机酸的细菌，于4℃置于斜面培养基中保藏以备进一步分析。

实施例2：产酸菌的分子鉴定

纯化筛选得到的细菌，取指数生长期新鲜菌液，离心收集菌体，采用基因组抽提试剂盒提取基因组DNA。采用细菌通用引物P₀-P₆扩增其16S rDNA全长序列，具体如下：

P₀：5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’