[发明专利]一种二苯甲酮的酶联免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及二苯甲酮残留检测方法，更具体的说是用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测包装材料纸中的二苯甲酮的残留，属于有毒化学品残留检测方法技术领域。

背景技术

二苯甲酮主要用于塑料等作为光稳定剂，能有效保护食品塑料包装以及有机玻璃等因光照变质，也是紫外线吸收剂、有机颜料、医药、香料、杀虫剂的中间体。由于二苯甲酮具有挥发性，在不具功能性阻碍的情况下会从食品包装迁移到食品中。经研究发现二苯甲酮会严重损害动物的肝肾组织，并会慢性致癌以及生殖毒性。欧盟食品安全局制定了含二苯甲酮及4-氨基二苯甲酮的印刷油墨食品包装的最大迁移限量，规定食品包装印刷油墨材料内的二苯甲酮迁移极限值须低于每公斤0.6毫克。目前，国内外有关二苯甲酮及4-氨基二苯甲酮的检测主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等，但这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，专业的操作人员，对检材的要求也比较高，并且需要进一步的样本前处理才能进行，这已经不能达到现代检测对快速、方便、准确的要求。目前尚未见国内外有二苯甲酮残留的酶联免疫检测的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测包装材料中二苯甲酮残留的免疫学检测方法，使样品无需经过繁琐的提纯或浓缩步骤，并且保证较高的敏感性和特异性。

本发明的技术方案如下：利用胥传来、许宙、林菲、陈莲君等“一种4-氨基二苯甲酮人工抗原的制备方法”，中国专利申请号201010182488.6，以4-氨基二苯甲酮为半抗原，此半抗原与BSA偶联物作为免疫原免疫健康新西兰大白兔得到多克隆抗体，此半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立了包装材料纸中二苯甲酮的间接竞争酶联免疫检测方法。

一种二苯甲酮的酶联免疫检测方法，利用合成的4-氨基二苯甲酮与BSA偶联物免疫原免疫得到多克隆抗体，以4-氨基二苯甲酮半抗原与卵清蛋白OVA的偶联物作为包被抗原，以二苯甲酮为标准品，建立了包装材料纸中二苯甲酮的间接竞争酶联免疫检测方法；步骤如下：

（1）以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释包被抗原1:1000~1:64000，加入酶标板中，每孔加入100μL，4℃孵育过夜，按照常规ELISA方法封闭洗涤；

（2）用PBST将二苯甲酮标准品稀释成0.5、1、5、10、20、50ng/mL系列浓度，将系列浓度之一的二苯甲酮标准品或待测样品加入酶标板中，每孔加50μL；同时加入以抗体稀释液稀释1:1000~1:4000的多克隆抗体，每孔加50μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤3~5次；

（3）以抗体稀释液将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP稀释为1:3000，每孔加100μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤3~5次；

（4）配置显色液

A液：0.933 g柠檬酸，3.68 g Na₂HPO₄·12H₂O，18 μL30%H₂O₂用超纯水定容至100 mL；

B液：60 mg 3,3^/,5,5^/-四甲基联苯胺TMB溶于100 mL乙二醇中；

使用前将A液与B液以5:1体积混合；

（5）每孔加入显色液100μL，37℃显色15min；每孔加入终止液2M 硫酸溶液100μL；酶标仪450nm测吸光值OD。

所述的二苯甲酮的酶联免疫检测方法，包装材料纸中待测样品的提取方法为：

(1) 取阴性样本-白纸为代表性样品，将其剪碎至5mm×5mm大小，混匀，分别称取1.0g试样置于100mL具塞锥形瓶中，然后将一定浓度的二苯甲酮标准品的甲醇溶液加入其中，使二苯甲酮在纸试样体系中的终浓度分别为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL，室温静置15 min；

(2) 在上述锥形瓶中继续加入20mL四氢呋喃，于超声波发生器中提取20min，将提取液滤出，残渣再用10mL四氢呋喃超声提取5min，再将提取液滤出，将两次滤液合并；

(3) 将滤液在40℃水浴旋转蒸发器中浓缩至近干，用甲醇溶解并定容至1mL，然后用氮气吹干，以含10%－20%甲醇的PBS溶解，即为待测样品，用于ELISA检测。

    所述二苯甲酮的酶联免疫检测方法，抗原抗体反应的pH值必须在中性或弱碱性的条件下进行。

更详细的步骤为：

主要溶液配制

1）配制0.01M磷酸盐(PBS)缓冲液：