[发明专利]一种二苯甲酮的酶联免疫检测方法

权利要求书

1.一种二苯甲酮的酶联免疫检测方法，其特征在于利用合成的4-氨基二苯甲酮与BSA偶联物免疫原免疫得到多克隆抗体，以4-氨基二苯甲酮半抗原与卵清蛋白OVA的偶联物作为包被抗原，以二苯甲酮为标准品，建立了包装材料纸中二苯甲酮的间接竞争酶联免疫检测方法；步骤如下：

（1）以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释包被抗原1:1000~1:64000，加入酶标板中，每孔加入100μL，4℃孵育过夜，按照常规ELISA方法封闭洗涤；

（2）用PBST将二苯甲酮标准品稀释成0.5、1、5、10、20、50ng/mL系列浓度，将系列浓度之一的二苯甲酮标准品或待测样品加入酶标板中，每孔加50μL；同时加入以抗体稀释液稀释1:1000~1:4000的多克隆抗体，每孔加50μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤3~5次；

（3）以抗体稀释液将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP稀释为1:3000，每孔加100μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤3~5次；

（4）配置显色液

A液：0.933 g柠檬酸，3.68 g Na₂HPO₄·12H₂O，18 μL30%H₂O₂用超纯水定容至100 mL；

B液：60 mg 3,3^/,5,5^/-四甲基联苯胺TMB溶于100 mL乙二醇中；

使用前将A液与B液以5:1体积混合；

（5）每孔加入显色液100μL，37℃显色15min；每孔加入终止液2M 硫酸溶液100μL；酶标仪450nm测吸光值OD。

2. 根据权利要求1所述的二苯甲酮的酶联免疫检测方法，其特征在于包装材料纸中待测样品的提取方法为：

(1) 取阴性样本-白纸为代表性样品，将其剪碎至5mm×5mm大小，混匀，分别称取1.0g试样置于100mL具塞锥形瓶中，然后将一定浓度的二苯甲酮标准品的甲醇溶液加入其中，使二苯甲酮在纸试样体系中的终浓度分别为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL，室温静置15 min；

(2) 在上述锥形瓶中继续加入20mL四氢呋喃，于超声波发生器中提取20min，将提取液滤出，残渣再用10mL四氢呋喃超声提取5min，再将提取液滤出，将两次滤液合并；

(3) 将滤液在40℃水浴旋转蒸发器中浓缩至近干，用甲醇溶解并定容至1mL，然后用氮气吹干，以含10%－20%甲醇的PBS溶解，即为待测样品，用于ELISA检测。

3.根据权利要求2所述二苯甲酮的酶联免疫检测方法，其特征在于抗原抗体反应的pH值必须在中性或弱碱性的条件下进行。