[发明专利]编码猪α-干扰素的DNA分子和重组大肠杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种编码猪α-干扰素的DNA分子和重组大肠杆菌及其应用。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是多功能细胞因子家族中的一员，是由具有正常生理功能的细胞在适宜的诱生剂的作用下产生的、能抑制病毒增殖的一类糖蛋白，具有广谱抗病毒、抑制细胞增殖、调节功能性细胞活性及对细胞分化与免疫的进行调控等方面的多种生物学功能。根据干扰素的细胞来源、生化特性及其生物学活性的差异，可分为I型和II型两大类型：其中I型干扰素包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-τ4个亚型，主要是由白细胞或成纤维细胞在病毒诱导下分泌的；II型干扰素主要有IFN-γ，一般不是由病毒诱导产生，而是由被PHA、ConA等抗原物质激活的T细胞和NK细胞合成的。

近年来重组DNA技术迅速发展，已广泛应用于各种生物制品的生产，基因工程重组人α-干扰素就是应用重组DNA技术生产的最早的蛋白药品之一，也是当今我国能自主生产的少数基因工程药物之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种适合在大肠杆菌中表达的编码猪α-干扰素的DNA分子。

本发明所提供的编码猪α-干扰素的DNA分子，其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1-501位。

本发明的编码猪α-干扰素的DNA分子，按照大肠杆菌密码子偏嗜性进行改造，适合在大肠杆菌中表达。

本发明的目的是提供一种遗传稳定、重组蛋白表达稳定的表达猪α-干扰素的重组菌。

本发明所提供的表达猪α-干扰素的重组菌，是稳定表达序列表中序列1自5’末端第1-498位所示的DNA分子编码的蛋白的重组大肠杆菌。

其中，所述大肠杆菌为大肠杆菌菌株M15[pREP4]。

本发明的表达猪α-干扰素的重组菌在有选择压力下经过传代培养重组菌含质粒率均在96％以上，在无选择压力下连续传代5代时质粒丢失率小于5％，经诱导表达后，目的蛋白表达量稳定，复性后蛋白的抗病毒活性均在1.0×10⁹U/mg以上。表达猪α-干扰素的重组菌表达、制备的猪α-干扰素中不存在重组质粒。

本发明的另一个目的是提供一种生产猪α-干扰素蛋白的方法。

本发明的生产猪α-干扰素蛋白的方法，包括如下步骤：

将表达猪α-干扰素的重组菌进行发酵罐发酵培养，诱导表达猪α-干扰素，收集菌体，破碎菌体，离心收集包涵体，洗涤包涵体，离心收集包涵体；

用含有5-8mol/L盐酸胍的缓冲溶液溶解包涵体，离心收集上清；

采用His-蛋白质镍亲和层析树脂纯化上清，收集目的蛋白峰；

测定收集的蛋白浓度，在冰水浴或者2℃-8℃的条件下，将收集的蛋白加入到复性液中使蛋白质浓度在75-150μg/mL L，2℃-8℃静置复性20-24小时，获得猪α-干扰素蛋白；所述复性液中盐酸胍0.3-1.0mol/L、尿素0.5-2.0mol/L、精氨酸0.1-1.0mol/L、还原型半胱氨酸1.0-7.0mmol/L、氧化型胱氨酸0.1-2.0mmol/L、Tris-HCl 10-20mmol/L(pH8-11)、EDTA 1.0-5.0mmol/L(pH8.0)；所述表达猪α-干扰素的重组菌是是稳定表达序列表中序列1自5’末端第1-498位所示的DNA分子编码的蛋白的重组大肠杆菌。

其中，所述大肠杆菌为大肠杆菌菌株M15[pREP4]。

本发明的再一个目的是提供一种猪α-干扰素蛋白注射液。

本发明所提供的猪α-干扰素蛋白注射液，其活性成分为上述生产猪α-干扰素蛋白的方法制备的猪α-干扰素蛋白的PBS溶液或者生理盐水溶液。

其中，还可含有适宜浓度的佐剂、稳定剂。如浓度为1～10％的葡萄糖或蔗糖，0.1～2.5％的甘露醇或山梨醇及适量浓度的甘油、氯化钠等。

本发明的生产猪α-干扰素蛋白的方法获得的α-干扰素蛋白能够有效地抑制VSV病毒对细胞的破坏作用，生物学活性均在1.17×10⁹U/mg以上。

本发明的猪α-干扰素，对猪是安全的；对仔猪日增重、生长猪料重比、受孕母猪生产繁殖性能无不良影响；对确诊的临床PED感染具有明显的治疗效果。接种猪α-干扰素的猪生活环境中没有抗性基因残留。

附图说明

图1为重组猪IFN-α的标准曲线。

具体实施方式

实施例

(一)猪α-干扰素基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达与复性