[发明专利]稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株及其建立和应用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种能够稳定指示细胞自噬活动同时又具备高转移潜能的肝癌细胞株，以及该细胞株的建立和应用方法。

背景技术

原发性肝癌是严重威胁人类健康的恶性疾病。其发病率虽只列恶性肿瘤发病率的第六位，但是死亡率却高居第三位。中国是原发性肝癌高发国，发病人数约占全球的55％。全国第三次死因回顾抽样调查报告显示：肝癌是我国恶性肿瘤相关死亡的第二位死因(在城市和男性则是首位死因)。如何有效防治肝癌是我国目前亟需解决的重大问题。

在影响肝癌患者生存的诸多因素中，转移复发是最为主要的因素。肝癌患者在就诊时，多数已发生转移而无法手术治疗，可手术治疗率只有15-30％。即使手术，患者术后5年的总体转移复发率也高达50-80％(多数于2年内复发)。因此，肝癌转移复发的防治是治疗肝癌的关键，相关的研究紧要而迫切。

自噬被认为可能在肝癌转移中起重要作用。自噬是一种细胞自我降解消化的过程，在细胞处于不利于细胞生存的应激条件时，细胞通过循环利用细胞内成份，维持营养和生物能量的稳定，清除受损或多余的蛋白质和细胞器，维持细胞自我稳态，维持细胞生存。其在肿瘤细胞克服不良应激(如缺血缺氧代谢应激、放化疗等细胞毒作用等)，维持癌细胞生存，进而促进肿瘤发生发展的重要作用已为近年来的研究证实。由于自噬在维持肿瘤细胞生存中的重要作用，而肝癌细胞转移又是一个不断克服不良环境作用的复杂过程，自噬一直被推测可能在肝癌细胞转移过程中起重要作用。

然而，这种推论一直未能得到很好的研究和证实，究其原因，主要是因为缺乏良好的研究工具和模型。要满足自噬与肝癌细胞转移的相关研究，需要有良好的研究用的肝癌细胞株。这个肝癌细胞株需要满足如下条件：具备高转移能力，能够在体内和体外很好地模拟癌转移过程；具备良好的自噬指示能力，能够实时显示自噬的改变并便于联合其他相关技术观察分析。

目前的肝癌细胞株尚不能满足研究所需。这主要是因为：(1)通用肝癌细胞株不具备高转移能力：目前广泛使用的肝癌研究工具细胞，如ATCC的HepG2等，不具备高转移能力，难以在体内和体外良好地复制转移过程(特别是体内转移)；(2)自噬指示观察及快速定量分析方法不足：目前自噬研究采用的自噬观察方法有很大的局限性，无法完成转移过程中自噬变化等观察。目前广泛用于观察自噬的方法主要包括透射电镜、吖啶橙染色荧光显微镜或流式细胞术，Western blot检测等。这些观察方法是通过对某个时间点的细胞进行断点取材观 察，对于实时动态观察存在不足，而转移是一个不断变化的动态的过程，因此很多过程无法观测到。例如：在侵袭移动过程中，癌细胞侵透胞外细胞基底膜运动的过程，即使在体外应用Matrigel模拟，这一运动过程中自噬的动态改变通过以上方法也很难观察；而癌细胞在进出循环系统以及在循环系统内播散时自噬的改变，定植扩增并形成转移灶时的改变，更难以观察。此外，这些方法还存在其它不足，如：透射电镜法样本制作过程繁琐，观察不便，难以定量或半定量分析；吖啶橙染色法特异性差，易于出现假阳性或假阴性结果，可靠性差；Western blot法检测步骤多、时程长，工作量大，检测费用高等。使用GFP绿色荧光蛋白标记LC3形成GFP-LC3自噬报告基因标记细胞使细胞指示自噬，借助荧光显微镜观察自噬活动，是近年来出现的一种新的自噬观察方法，这种方法使得实时动态观察自噬改变成为可能。该方法利用自噬发生过程中自噬关键分子LC3由LC3-I变为LC3-II，LC3在细胞内的分布发生改变(由LC3-I的细胞胞浆内弥散分布变为LC3-II的富集于自噬体上)，以GFP标记LC3分子，通过荧光分布的改变(由GFP-LC3-I弥散分布于细胞质之弥散绿色荧光变为GFP-LC3-II富集于自噬体上形成绿色荧光亮点)及变化程度来观察分析自噬的发生和发生强度。理论上，该方法具有实时动态观察、简便快捷等诸多优势，但在实际工作中却不易实现。其主要问题在于缺乏能够高效稳定地将GFP-LC3基因导入细胞并使之稳定表达的方法。目前广泛应用的建立表达GFP-LC3基因的方法是通过脂质体转染方法(瞬时转染)将携带GFP-LC3基因的重组表达质粒转入细胞内并使其在细胞内表达。GFP-LC3瞬时转染法建立的GFP-LC3表达不稳定，导致自噬指示不稳定，细胞在连续传代后自噬指示减弱或丧失，而转移过程是一个时间跨度较大的过程，这使得其难以满足转移过程的自噬观察(特别是在体内转移模型观察时)。例如：模式生物是高可信的研究方法，应用小鼠或斑马鱼于体内建立转移模型进行研究是获得最接近人体试验结果的可靠方法。而应用人肝癌细胞建立该模型，需要细胞能够稳定指示自噬，以目前通用的瞬时转染技术产生的自噬指示细胞，于体内种瘤，在细胞分裂多次瘤生长至一定大小后(远在癌细胞转移发生之前)，GFP-LC3自噬指示即减弱或丧失，这使得体内观察转移过程中自噬的改变无法实现。传统的GFP-LC3研究方法除存在上述稳定表达方面的不足外，还存在应用方法方面的严重不足：缺乏快速可靠的自噬定量分析方法。传统的自噬定量方法为人工肉眼计数GFP-LC3自噬荧光亮点，再人工计数细胞，计算获得平均荧光亮点数/细胞。人工计数工作量很大(每一个处理组总计数细胞量通常在200以上，总荧光亮点计数量通常在1000以上)，尤其是在多因素、大样本量实验时工作非常繁重，计数者易于视疲劳计数出错，可靠性较差，同时人工计数主观随意性大，定量分析结果因缺乏足够客观性而可信度有限等。此外，传统的GFP-LC3方法还存在其他一些不足，包括转染效率低下、转染试剂具有细胞毒性和自噬诱导作用等。其中转染试剂的自噬诱导作 用对于自噬的相关研究有较大影响，因为转染试剂可诱导自噬，并在转染试剂去除后仍维持较长时间，造成本底背景自噬很高，在背景自噬高的情况下，将难以准确判断自噬的发生及改变。