[发明专利]稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株及其建立和应用方法

权利要求书

1.稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株，其特征是：①稳定指示细胞自噬：细胞稳定表达EGFP-LC3自噬报告基因，可在激发波长为488nm、发射波长为509nm的条件下用荧光显微镜进行观察，通过EGFP-LC3的胞内荧光分布改变指示细胞自噬活动，荧光稳定不淬灭；EGFP-LC3基因整合入宿主细胞基因组，传代不丢失，表达稳定，其荧光强度不随细胞传代而减弱；②细胞具备高转移潜能：细胞在裸鼠皮下成瘤6-8周或肝脏原位种植5-6周后可自发形成肺转移。

2.一种建立权利要求1所述的稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株的方法，其特征是：建立所述细胞株的步骤如下：

①构建EGFP-LC3慢病毒表达载体：人工合成人LC3基因，插入pUC57载体，构建成pUC57-LC3；用Nhe I和Age I对pUC57-LC3进行双酶切，获得384bp的LC3基因片段；用Nhe I和Age I对pLV-UbC-EGFP-3FLAG表达质粒进行酶切，将LC3基因连接入表达质粒，构建成pLV-UbC-EGFP-LC3表达质粒；将表达质粒pLV-UbC-EGFP-LC3和包装质粒pRsv-REV，pMD1g-pRRE，pMD2G混合，于293T细胞包装形成EGFP-LC3慢病毒；纯化，浓缩、测定滴度；②以EGFP-LC3慢病毒感染高转移潜能肝癌细胞：取对数生长期细胞，30％融合，以MOI＝40计算所需病毒量，病毒与polybrene混匀于培养液后作用对象细胞，感染后36-48h换液，72h后荧光显微镜下观察确认后继续培养扩增；③分选筛选及培养扩增：以488nm光激发，使用配有高级荧光活性细胞分选器的流式细胞仪在无菌条件下分选出表达荧光强度在荧光强度均值以上的细胞，获得稳定指示细胞自噬活动的高转移潜能肝癌细胞株，常规培养扩增。

3.一种应用权利要求1所述的稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株的方法，其特征是：利用该细胞株实现细胞自噬指示并采用基于Top-hat算子的图像分析方法定量分析自噬改变，其具体步骤如下：①以自噬研究相关处理因素处理权利要求1所述的稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株；②采用荧光显微镜在激发波长为488nm、发射波长为509nm的条件下观察细胞内荧光改变，于同一条件下摄取荧光图像，每个处理组随机取至少五个视野，使受分析细胞总数＞500；③以专业生物图像分析软件之Top-hat算子模块、形态滤波模块实现以下图像运算分析，提取EGFP-LC3自噬荧光亮点：以Top-hat算子结合disk结构元素运算抑制去除荧光背景，进一步以大小一定的圆形设置形态滤波过滤去除假阳性干扰目标，提取出EGFP-LC3自噬荧光亮点；④以专业生物图像分析软件之点自动计数模块计数提取出的EGFP-LC3自噬荧光亮点，获得总荧光亮点数；⑤以专业生物图像分析软件之细胞计数模块或人工计数受分析细胞数；⑥计算每个细胞的平均荧光亮点数，重复以上步骤，数据输入统计软件，统计分析。