[发明专利]呋喃它酮残留物无标记阻抗型免疫传感器及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于药物残留检测领域；具体涉及呋喃它酮残留物无标记阻抗型免疫传感器及其制备方法和应用。

背景技术

硝基呋喃类药物是人工合成的广谱抗生素，它有非常好的抗菌作用和药理动力学特性，除了作为一种抗生素被应用于兽医医疗中外，它还曾作为猪、禽与水产品促生长的添加剂被广泛应用。但在长时间的实验室研究过程中发现，硝基呋喃类药物及其代谢产物均可以使实验动物发生癌变和基因突变，鉴于此，欧盟分别于1993年（欧盟法令2901/93）与1995年（欧盟法令1442/95）立法禁止在动物源性食品生产加工过程中使用呋喃它酮（Furaltadone）、呋喃西林(Nitrofurazone)、呋喃咀啶(Nitrofurantoin)与呋喃唑酮(Furazolidone)等四种药物。其后，美国、加拿大、澳新与日本等国均全面禁止使用硝基呋喃类药物。2002年3月我国也将硝基呋喃类药物列为禁用兽药。研究证明，硝基呋喃类药物在动物体内若干小时就会迅速分解成硝基呋喃与各种代谢产物，这些代谢产物与组织内蛋白质形成较为稳定的化合物，该化合物可以在组织中存留较长时间，所以分析此类药物残留时应该对其代谢产物进行检测分析，欧盟等国就是以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃残留的目的。四种硝基呋喃类药物的代谢产物分别对应为：呋喃它酮—3-氨基-5-吗啉基-2-氧唑酮（AMOZ）；呋喃西林—氨基脲（SEM）；呋喃咀啶—1-氨基咀啶（AHD）；呋喃唑酮—3-氨基-2-氧唑酮（AOZ）。

随着我国加入世贸组织以来，欧美日等发达国家利用自身技术优势对我国出口食品及农副产品不断设置新的技术壁垒措施，以达到限制我国食品与农副产品的出口，有关这方面的贸易纠纷接踵而来，欧盟早在2000年初就开始了一项长达42个月的FoodBRAND计划(QLK1-1999-00142)，其主要目的是要求欧盟各认可实验室对食品中硝基呋喃类残留检测方法（包括ELISA与LC-MS-MS方法）进行攻关研究，以为其设置技术壁垒提供技术支持。目前，欧盟规定不得在食品中检测出硝基呋喃类药物四种代谢产物残留，鉴于此，欧盟等国家已研制出液质联用色谱仪检测分析方法，同时也有酶联免疫检测试剂盒的制备和使用，我国相关科研人员也研制成功上述检测方法。但目前已有的针对上述残留物的快速检测方法（ELISA与LC-MS-MS方法）由于均需对残留物进行衍生化处理，检测工作量大，需耗费至少24小时，所需时间较长，达不到快速检测的要求。

本发明旨在通过免疫传感器的制备，建立一种呋喃它酮残留快速检测方法。

发明内容

本发明的目的是为人们提供一种呋喃它酮残留物无标记阻抗型免疫传感器及其制备方法和应用。

本发明所说的呋喃它酮残留物无标记的阻抗型免疫传感器，是将纳米金通过自组装方法固定于金电极表面，用来固定呋喃它酮残留物的单克隆抗体而构建得到。

上述呋喃它酮残留物无标记的阻抗型免疫传感器具体是通过以下步骤制得：

（1）金胶的制备：制备金纳米粒子溶液；

（2）金电极的预处理：金电极先用0.3，0.05μm的三氧化二铝粉末在丝绸上抛光，然后依次用二次水和无水乙醇超声清洗；再将抛光处理好的金电极置于0.5M H2SO4溶液中，在-0.5到+1.4V范围内进行循环伏安扫描25圈，扫速为0.1V s-1；然后将电极在氮氛下干燥；

（3）1，4-苯二硫醇修饰金电极：将预处理好的金电极浸入含15 mM的1，4-苯二硫醇的无水乙醇溶液中，4oC下放置10 min，然后用无水乙醇冲洗表面，再在氮氛下干燥；

（4）单层纳米金胶的自组装：将自组装了1，4-苯二硫醇的金电极浸入金胶溶液中，放在暗处置于室温下5h后，取出后用二次水冲洗表面；

（5）抗体的固定：将纳米金修饰电极浸入含0.030 mg/mL AMOZ抗体的磷酸缓冲溶液（pH7.0）中，于4°C下放置12 h；然后将其取出后再放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白溶液中，置于37.5oC水浴中1小时，以封闭非特异性位点；最后将取出后的电极用二次水冲洗以除去表面多余的牛血清蛋白；即制得呋喃它酮残留物无标记的阻抗型免疫传感器。

本发明还公开了使用上述呋喃它酮残留物无标记的阻抗型免疫传感器检测呋喃它酮残留物的方法，具体是：