[发明专利]一种c-KIT基因突变检测液相芯片

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种c-KIT基因突变检测液相芯片。

背景技术

胃肠间质瘤(gastrointestinal stroml tumor，GIST)是来源于胃肠道的一种特殊肿瘤。近年来随着对GIST分子病理的深人研究和靶向药物的应用，GIST越发引起人们的关注。手术切除至今仍是GIST惟一根治性治疗手段，但复发率极高。分子靶向药物甲磺酸伊马替尼(格列卫)在GIST的治疗中取得了非常好的疗效，是当今GIST患者的首选药物。

伊马替尼的作用机制是抑制血小板衍化生长因子(PDGFR)受体和c-KIT受体的酪氨酸激酶，从而抑制由PDGFR和c-KIT介导的细胞行为，继而抑制GIST细胞的增殖并诱导其凋亡。其中c-KIT基因是HZ4猫科肉瘤病毒kit癌基因的同源物，位于人染色体4q12-13。c-KIT是白色斑点显性基因的等位基因，属于原癌基因，其产物是III型酪氨酸激酶，编码145kD的跨膜糖蛋白-酪氨酸激酶受体。

研究表明，GIST的c-KIT基因突变率＞85％，突变主要见于恶性GIST。c-KIT突变有多种形式，常见的有3-21碱基对丢失、点突变，偶见插入性突变。突变可以发生在胞外区(外显子9突变约5％-10％)、激酶区(外显子13突变约5％；外显子17突变占5％)，胞膜区的外显子11大约57％-71％突变。其中发生在外显子17上的突变D816H/V对伊马替尼耐药，而发生在外显子9上的AY502-503重复、外显子11上的突变V560G以及外显子14上的T670I突变对伊马替尼部分耐药。因此，检测GIST患者c-KIT基因突变情况可用于判断格列卫治疗能否有效，对于指导GIST患者的合理用药，具有重要的参考价值。

目前对c-KIT基因突变的检测产品主要有定量PCR、直接测序法、Pyrosequencing焦磷酸测序技术、DHPLC等，存在灵敏度低、样品易污染、假阳性率高、价格昂贵等缺点，同时由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。

发明内容

本发明的目的是提供c-KIT基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于检测c-KIT基因四种常见基因型AY502-503dup、V560G、T670I、和/或D816H/V的野生型和突变型。

一种c-KIT基因突变检测液相芯片，主要包括有：

(A)针对c-KIT基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：针对AY502-503dup突变位点的SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11、针对V560G突变位点的SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13、针对T670I突变位点的SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15、和/或针对D816H/V突变位点的SEQ ID NO.16及SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.9；

(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.27中的序列，所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；

(C)用于扩增出具有AY502-503dup、V560G、T670I、和/或D816H/V的突变位点的c-KIT基因目标序列的扩增引物。

优选地，所述扩增引物为：针对AY502-503dup和V560G突变位点的SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29、针对T670I突变位点的SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31、和/或针对D816H/V突变位点的SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明所提供的液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％。所制备的c-KIT基因突变检测液相芯片具有很好的信号-噪声比，并且所涉及的探针以及anti-TAG序列之间基本上不存在交叉反应，TAG标签序列、anti-TAG标签序列的选取以及TAG标签序列与具体ASPE引物的结合，均能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。

(2)本发明设计的ASPE特异引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型号的基因型。