[发明专利]一种用环介导恒温扩增法检测破伤风杆菌的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更具体的说是涉及一种用环介导恒温扩增法检测破伤风杆菌的方法，还涉及一种用环介导恒温扩增法检测破伤风杆菌的试剂盒。

背景技术

破伤风是感染破伤风杆菌引起的传染病，是由破伤风杆菌侵人人体伤口并在伤口内繁殖和产生外毒素所引起的一种急性特异性感染.临床上以患者全身或局部肌肉持续性痉挛和阵发性抽搐为主。

破伤风杆菌是一种专性厌氧性梭状芽胞杆菌，革兰氏染色阳性，属条件致病菌，病菌只有在无氧的条件下或伤口较深并且伴有有氧菌感染的情况下易生长繁殖。破伤风杆菌平时存在于人畜的肠道，随粪便排出体外，以芽胞状态分布于自然界，尤以土壤中为常见，此菌对环境有很强的抗力，能耐高温。破伤风杆菌及其毒素不能侵入正常的皮肤和粘膜，故破伤风都发生在伤后。一切开放性损伤，均有发生破伤风的可能，如战伤、地震后创伤、工伤、烧伤、冻伤等。除了可能发生在各种创伤后，破伤风还可能发生于不洁条件下分娩的产妇和新生儿。

破伤风杆菌作用于人体后会产生一种外毒素，使人体表现出非常剧烈的咀嚼肌和躯干肌的抽搐，患者常常会牙关紧咬、身体不由自主地往后仰，有时外界环境，如声、光、震动的轻微刺激，就可引起患者剧烈抽搐和大量出汗，严重的患者还会引起呼吸的麻痹，导致死亡。

因此，及早地检测破伤风杆菌有助于预防破伤风的发生。目前，破伤风杆菌的鉴定主要是分泌物直接涂片、核酸分析、厌氧培养法和全自动细菌培养鉴定仪鉴定。直接涂片法快速、经济，但容易与其他菌类混淆，特异性和灵敏性较低；厌氧培养法为目前破伤风杆菌鉴定的金标准，但培养条件高、耗时长(约18-72h)，往往错过最佳治疗时间，造成严重后果；全自动细菌培养鉴定仪鉴定同样需要对检测样品进行厌氧培养，由此造成了检测时间长的缺点；核酸分析主要是用荧光定量PCR技术，但现行的PCR技术存在着多种缺陷：(1)条件要求高，要求在三个不同的操作区间分别完成试剂准备、标本前处理、基因扩增及检测等过程；(2)操作复杂，需进行标本变性、DNA提取、PCR扩增、荧光检测等多个步骤。此外还需要水浴锅、电炉、离心机、超净台、扩增仪等仪器；(3)检测时间长，耗时3-4h。因此严重制约了该技术在临床的广泛开展，尤其是制约了在基层医疗单位、床旁检验及现场紧急检测的应用。

随着分子诊断技术的不断进步，一些新的核酸分析技术相继问世，环介导恒温扩增技术就是其中之一。虽然环介导恒温扩增法具有高特异性、高灵敏度和扩增时间短的优点，但使用时需自行设计引物，引物设计的准确与否关系到检测的特异性和灵敏度。此外，环介导恒温扩增法没有配套的DNA快速提取方法，在标本的前处理上仍较繁杂，耗时较长。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用环介导恒温扩增法检测破伤风杆菌的方法及其试剂盒，该检测方法及其试剂盒对破伤风杆菌特异性高、灵敏度高，检测过程简单快速。

本发明提供一种用环介导恒温扩增法检测破伤风杆菌的方法，包括：

利用环介导恒温扩增技术，用上游内引物、下游内引物、上游外引物和下游外引物扩增样品DNA中的破伤风杆菌痉挛毒素基因，所述上游内引物具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述下游内引物具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述上游外引物具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述下游外引物具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；

检测扩增结果。

环介导恒温扩增技术的基本原理是针对靶基因的4个区域设计2对特异引物(1对内引物和1对外引物)，在恒温63-67℃保温40-80min，利用高活性链置换DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，使得链置换DNA合成在不停地自我循环，从而产生大量茎环状扩增产物。该技术的特点是：①高特异性：针对靶基因的4个区域设计4种特异引物，能同时非特异性结合4个区域的干扰核酸极少；②恒温、简便：在恒温条件下扩增，操作简便；③高灵敏度：在30-40min内可把靶序列扩增至10⁹-10¹⁰倍，其最低检测极限在10个拷贝/TEST左右。