[发明专利]一种用环介导恒温扩增法检测破伤风杆菌的方法及试剂盒有效
| 申请号： | 201010292470.1 | 申请日： | 2010-09-21 |
| 公开（公告）号： | CN101948923A | 公开（公告）日： | 2011-01-19 |
| 发明（设计）人： | 蒲晓允;蒋栋能;项贵明;王左 | 申请（专利权）人： | 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12Q1/04 |
| 代理公司： | 北京集佳知识产权代理有限公司 11227 | 代理人： | 逯长明 |
| 地址： | 40003*** | 国省代码： | 重庆;85 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 用环介导 恒温 扩增 检测 破伤风 杆菌 方法 试剂盒 | ||
1.一种用环介导恒温扩增法检测破伤风杆菌的方法，其特征在于，包括：
利用环介导恒温扩增技术，用上游内引物、下游内引物、上游外引物和下游外引物扩增样品DNA中的破伤风杆菌痉挛毒素基因，所述上游内引物具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述下游内引物具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述上游外引物具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述下游外引物具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；
检测扩增结果。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述样品DNA经由以下步骤提取：
样品与DNA快速提取液充分混匀，加热至沸腾并维持1min，离心或过滤，所得上清液或滤液为包含样品DNA的溶液，所述DNA快速提取液包含0.1-0.3mol/L的NaOH和1.0-2.0％的Triton X-100。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述检测为通过钙黄绿素和MnCl2与扩增副产物焦磷酸镁作用发生颜色变化进行检测。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述环介导恒温扩增技术运行条件为恒温63-67℃保温40-80min。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述检测为利用散射比浊法检测。
6.一种用环介导恒温扩增法检测破伤风杆菌的试剂盒，其特征在于，包括：
上游内引物、下游内引物、上游外引物和下游外引物，所述上游内引物具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述下游内引物具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述上游外引物具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述下游外引物具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，还包括DNA快速提取液，所述DNA快速提取液包含0.1-0.3mol/L的NaOH和1.0-2.0％的Triton X-100。
8.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，还包括恒温扩增液，所述恒温扩增液包含20mmol/L pH8.8的Tris-HCl、10mmol/L的KCl、10mmol/L的(NH4)2SO4、2mmol/L的MgS04、0.1％的Triton X-100、40mmol/L的dNTP、320U/mL的Bst DNA聚合酶。
9.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述DNA快速提取液包含0.2mol/L的NaOH和1.25％的Triton X-100。
10.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，还包括显色液，所述显色液包含1.5-2.5mmol/L钙黄绿素和2-4mmol/L MnCl2。
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