[发明专利]一种高产纳豆激酶液体发酵方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域。涉及纳豆激酶高产菌株的选育，豆粕酶解液制品和纳豆激酶的液体发酵方法。

背景技术

血栓性疾病严重威胁着人类的生命与健康，其发病率和死亡率居各种疾病之首。溶解血栓是治疗这类疾病的首选方法。目前临床上治疗血栓主要是通过注射链激酶(Streptokinase，SK)、尿激酶(Urokinase，UK)、组织型纤溶酶原激活剂(Tissue-type Plasminogen Activator，t-PA)和单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(Single-chain Urokinase Type Plasminogen Activator，scu-PA)等。这些药物均为纤溶酶原激活剂，通过激活纤溶酶原生成纤溶酶而降解纤维蛋白。但在实际应用中它们都具有一定的局限性，或毒性强，副作用大，或体内半衰期比较短，或生产成本高，价格昂贵等，难以成为适用的大众药品。

1987年须见洋行在日本的传统发酵食品纳豆中发现了一种具有强烈纤溶活性的酶，定名为纳豆激酶(Nattokinase，NK)，是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilis natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶，它可分泌到细胞外。研究表明，NK是一种丝氨酸蛋白酶，能显著溶解体内外血栓，具有很强的纤溶活性，不但能直接作用于纤溶蛋白，而且还能激活体内纤溶酶原，从而增加内源性纤溶酶的量与作用。纳豆激酶在人体的活性半衰期远远超过目前临床上治疗血栓所使用的溶栓制剂和半衰期，一般在8～10小时。此外纳豆激酶也具有一定的激酶作用，可激活内源酶原。具有安全性好，作用迅速，成本低，可由细菌发酵生产等优点，可用于开发新一代溶栓剂或保健食品，是一种很有潜力的新型口服溶栓药物，具有极为广阔的前景。

由于纳豆激酶具有目前市场上正在使用的溶栓药物所不具有的优点，那么提高纳豆激酶的单位产物的酶活力和生产效率对纳豆激酶的推广具有重要的意义。在发酵的方式上，纳豆激酶现在的生产方式主要是以发酵为主，发酵工艺有液体发酵和固体发酵两种。传统发酵方式为固体发酵即直接以黄豆为原料进行发酵产酶，产物即传统食品纳豆。这种方式的特点是操作比较简便、工艺简单，但是若想进一步分离提取纳豆激酶却十分复杂，同时，纳豆具有的特殊气味直接影响人们对它的接受程度。从工业角度考虑，由于固态发酵易染菌，难散热，回收率低，很难满足有严格要求的药品尤其是生物制品的生产要求，因此我公司采用纳豆激酶的液态发酵方式，解决了纳豆激酶工业化放大的技术难题，同时也为后期提取纯化降低了成本。目前关于纳豆激酶的液体发酵的专利有：申请号为02116667的发明专利申请、申请号为02121352.6的发明专利申请、申请号为200610129353.7的发明专利申请，以及纳豆激酶液体发酵的优化和分离纯化及酶学性质的研究》、《纳豆激酶高产菌株筛选及发酵工艺优化研究》、《纳豆激酶的发酵工艺及其制剂学研究》等文章。分别介绍了不同纳豆激酶液体发酵的方法，其所用主要原料为大豆蛋白胨，酵母膏、牛肉膏为原料直接进行发酵，这些方法生产的纳豆激酶的酶活并不高，而且价格较贵，因此在纳豆激酶的工业化生产上受到了一定的限制。本发明的目的就是针对液体发酵方法的不足，提供一种自己筛选的纳豆激酶的高产菌株，并采用豆粕酶解液作为氮源进行液体发酵的方法，，节约了成本的同时也提高了纳豆激酶的生产效率和酶活。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产纳豆激酶液体发酵方法，克服现有技术的不足，提供一种产酶率高，酶活力强的纳豆激酶菌株，提供一种提取工艺简便易行，节省能源和原料，成本低，对环境的污染少的液体发酵工艺。采用纳豆激酶的固体发酵高产菌株H-13，经诱变驯化筛选得到的用于液体发酵的高产菌株W-0923，以大豆蛋白胨为氮源进行摇瓶阶段的发酵，以豆粕的胰蛋白酶解液作为主要的氮源进行10L液体发酵。

本发明的技术方案为：一种高产纳豆激酶液体发酵方法，包括以下步骤：

(1)纳豆激酶液体发酵菌株的筛选及诱变驯化

选用纳豆固体发酵高产菌株H-13，采用紫外，微波诱变，高浓度纤维蛋白原驯化平板的方法进行纳豆激酶高产菌株的筛选，得到高产菌株W-0923。确定了紫外线诱变菌株的最适条件为40W紫外灯，照射距离为30cm，菌悬液浓度为100个/mL，照射时间为20s。微波诱变的最适条件为：频率为2450MHz的700W微波炉进行微波诱变，最适菌悬液浓度10⁴个/mL，作用时间为5s。

(2)豆粕酶解液的制备