[发明专利]用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及了一种培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，特别是用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法。

背景技术

人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hESC)最初由Thomson等于1998年从处于囊胚阶段的早期胚胎中分离。通过分离人囊胚内细胞团，以35Gyγ射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)作为培养层体外培养，约9-15天后将细胞团吹散，然后继续在MEF上培养，挑选具有均一未分化形态的单克隆细胞团进行培养，如此重复培养至成系。hESC具有自我更新和分化的全能性的特点，注射到重症联合免疫缺陷的小鼠(severe combined immunodeficiency mice，SCID)中，可获得包含3个胚层分化细胞的畸胎瘤；体外悬浮培养hESC可发育成胚样体(embryoid body)，亦可检测到3个胚层的细胞存在。

为使体外培养的hESC长久地保持未分化状态，除特殊的培养条件外，需要与滋养层细胞(feeder layer)共培养。培养层细胞(例如MEF)能分泌多种细胞因子，抑制hESC的自发分化(Martin，1981)。但由于MEF属鼠源的特性，出于临床应用的安全性考虑，为防止动物源性病原体的传播，MEF作为培养层细胞培养hESC的临床应用受到了极大的限制。研究人员尝试开发人体组织作为培养层细胞，如胚胎皮肤、肌肉组织，成人输卵管上皮细胞，尿道内皮细胞，包皮成纤维细胞，成体骨髓基质细胞等(Cheng et al.，2003；Hovatta et al.，2003；Inzunza et al.，2005；Lee et al.，2005；Richards et al.，2003)。然而这些细胞的实际取材非常困难，加上伦理学的限制，使其作为大规模临床应用培养hESC的培养层细胞几乎不可能。

因为hESC分离培养自人胚胎组织，伦理学问题极大的限制了它在临床上的实际应用。2006年和2007年，日本科学家山中伸弥带领的研究团队分别发现了小鼠体细胞和人的成熟体细胞能通过人工方法诱导成具有hESC特点的多潜能干细胞，命名为人源性人工诱导多潜能干细胞(iPS：Induced pluripotent stem cell)(Takahashi K et al.，2006；Takahashi K et al.，2007)，这一发现一举克服了hESC应用范畴的伦理学问题，为若干非感染性疾病的治疗开启了希望之门。iPS细胞技术在全世界实验室中逐渐被成熟和完善，其安全性也逐渐得到了加强，比如现在已不需要使用病毒介导即可达到诱导iPS细胞的目的，成瘤性问题也逐渐得到了解决(Kaji et al.，2009)。然而，iPS细胞的培养和hESC一样，需要动物源性的MEF作为饲养层细胞才能使之保持未分化的状态，这一问题成为了iPS临床应用中的一大亟需克服的障碍和难题。

发明内容

本申请的发明目的在于克服现有技术的缺陷，而提供一种安全可靠地培养未分化的人源性人工诱导多潜能干细胞的方法。

为了完成本申请的发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的一种用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，它包括以下步骤：

(1)用人羊膜间充质细胞的培养基，将体外的人羊膜间充质细胞培养在15cm的细胞培养瓶中达到80-90％融合；

其中：(2)去掉步骤(1)中的人羊膜间充质细胞的培养基，加入10ml新鲜人羊膜间充质细胞的培养基，在该培养基中加入100μl浓度为1mg/ml的丝裂霉素C混匀，然后将其放置于36.5-37.5℃的CO₂细胞培养箱中40分钟，去掉含有丝裂霉素C的培养基，再用10ml D-Hank′s平衡盐溶液洗涤3次，再加入15ml的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基备用；