[发明专利]用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法

权利要求书

1.一种用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，它包括以下步骤：

(1)用人羊膜间充质细胞的培养基，将体外的人羊膜间充质细胞培养在15cm的细胞培养瓶中达到80-90％融合；

其特征在于：

(2)去掉步骤(1)中的人羊膜间充质细胞的培养基，加入10ml新鲜人羊膜间充质细胞的培养基，在该培养基中加入100μl浓度为1mg/ml的丝裂霉素C混匀，然后将其放置于36.5-37.5℃的CO₂细胞培养箱中40分钟，去掉含有丝裂霉素C的培养基，再用10ml D-Hank′s平衡盐溶液洗涤3次，再加入15ml的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基备用；

(3)将在15cm细胞培养瓶中生长到直径为4mm-6mm的人源性人工诱导多潜能干细胞去掉多余的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，只在细胞培养瓶保留5ml的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，加入浓度为10mg/ml的胶原酶IV，使胶原酶IV的最终浓度为1mg/ml，混匀后置于36.5-37.5℃的CO₂细胞培养箱中15分钟，去掉含胶原酶IV的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，用10ml Knockout DMEM洗涤3次后，再加入10ml人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，用5ml移液管对准克隆的人源性人工诱导多潜能干细胞快速吹打，使其脱落在培养基中，对于贴附紧密的人源性人工诱导多潜能干细胞，可用移液管轻刮人源性人工诱导多潜能干细胞，用机械力使其脱落，待人源性人工诱导多潜能干细胞全部脱落在培养基后，再次吹打使其破碎成较小的人源性人工诱导多潜能干细胞的细胞团，然后将其转移到4个预处理过的上述步骤(2)的培养瓶中，每瓶放入2.5ml；

(4)在室温下，对步骤(3)培养瓶中的细胞进行培养，每隔1天更换一次人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，待3-4天后长出肉眼可见的人源性人工诱导多潜能干细胞后，每天更换一次人源性人工诱导多潜能干细胞培养基，每隔7天传代一次，待人源性人工诱导多潜能干细胞生长到4mm-6mm，重复步骤(3)或经过步骤(3)破碎成较小的人源性人工诱导多潜能干细胞的细胞团后进行使用。

2.如权利要求1所述的一种用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，其特征在于：步骤(1)包括以下步骤：将体外人羊膜间充质细胞放置在装有人羊膜间充质细胞培养基的15cm细胞培养瓶中，待细胞密度达到90％融合以上，去掉培养基，用5ml D-Hanks′平衡盐溶液洗涤3次，再加入2ml 0.25％的胰蛋白酶放于36.5-37.5℃的CO₂细胞培养箱内2-3分钟，在显微镜下观察，待大部分细胞边缘发亮时，拍打培养瓶，使细胞处于悬浮状态，加入5ml的含有DMEM/F12和10％胎牛血清的终止液，将其转移到50ml离心管中，加入30ml D-Hanks′平衡盐溶液，在室温下将其放入离心机中以1000r/min的转速离心5分钟，然后将上述溶液中的上清液倒掉，再加入30ml人羊膜间充质细胞培养基使细胞重新悬浮，用移液管吹打均匀上述细胞，再将上述细胞平均种植到3个15cm细胞培养瓶中后，放置在36.5-37.5℃的CO₂细胞培养箱内，每隔3天换一次羊膜间充质细胞培养基，培养到在15cm的细胞培养瓶中达到80-90％融合。

3.如权利要求1或2所述的一种用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，其特征在于：所述的人羊膜间充质细胞的培养基包括：DMEM/F12、5％胎牛血清、2％B27、20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、20ng/ml的表皮生长因子和0.2g/l的L-谷氨酰胺。

4.如权利要求3所述的一种用人羊膜间充质细胞作培养层来培养人源性人工诱导多潜能干细胞的方法，其特征在于：所述的人源性人工诱导多潜能干细胞培养基包括：KnockoutDMEM、20％Knockout血清替代物、2mmol/l的L-谷氨酰胺、1×10^-4mol/l的非必需氨基酸、4ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、0.5％的青霉素、0.5％的链霉素和1×10^-4mol/l的2-巯基乙醇。