[发明专利]一种广谱高效提取植物RNA的试剂盒

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种广谱、高效提取植物RNA的方法，属于生物化学技术领域，适用于从各种植物，包括富含多糖多酚及次生代谢物质的顽拗性植物组织中提取高质量的总RNA。 

二、背景技术

从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。要进行Northern杂交分析，纯化mRNA以用于体外翻译或构建cDNA文库，大规模转录组和miRNA测序分析，基因芯片分析，RT-PCR及差显分析等功能基因组学和分子生物学研究，都需要高质量的完整RNA。因此，从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是顺利进行上述研究的基本前提，同时也是关键步骤。 

植物组织富含酚类化合物、多糖以及某些尚无法确定的次生代谢产物，而且RNase的活性较高。在完整的细胞内，这些物质与核酸因区隔化分布而在空间上彼此隔离，但当组织被研磨，细胞结构破坏之后，这些物质就会与RNA相互作用：酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时RNA的丢失，或形成不溶性复合物；而多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来；萜类化合物和RNase会分别造成RNA的化学降解和酶解。一些顽拗性植物例如棉花、马尾松、香蕉等由于缺乏成熟的商业试剂盒或者提取方法用于提取完整的、高质量、高产率的RNA是这些植物分子生物学研究中的一大挑战。 

以重要的农作物棉花为例：棉花的各种组织特别是花药、胚珠、纤维细胞内常含有丰富的多糖、脂类以及多酚、色素等次生物质，而这些物质在RNA提取过程中很难去除干净。多糖、脂类的存在不仅会使RNA的溶解度降低，还可以抑制许多工具酶的活性，且多酚、色素等物质在提取过程中很容易被氧化导致RNA变褐，影响对RNA的进一步分子操作。现有的商业试剂盒Trizol(Gibco-BRL生命技术公司)、RNeasy(Qiagen)等都不能有效提取棉花组织的RNA，有的产率为零。目前国内外广泛采用CTAB法和热硼酸法提取棉花组织的RNA，其中CTAB法被认为可以用于提取棉花根、茎、叶、幼嫩胚珠等组织的RNA，热硼酸法则可以用于提取纤维中的RNA。但是在实际应用中这两种方法都有缺点：一是提取成功率只能达到60％，二是提取RNA的质量不够高，不能满足RNA表达谱测序等一些对RNA质量要求高的分析研究的需要。国内某研究机构因为没有找到合适的提取方法使有关研究停滞三年之久，而采用本方法之后，经Agilent 2100Bioanlyzer检测，即达到了规定的质量要求，使有关工作得以进行。 

本方法以棉花为初始试验材料，在比较、分析、综合现有的十三种RNA提取方法的基础上，认识到缓冲系统是决定棉花组织RNA提取成功与否以及质量高低的最重要因素。筛选出硼酸缓冲液为RNA提取液的最佳缓冲体系，采用该体系可以高效提取植物组织中的RNA。用该体系提取粗RNA之后，再用使用CTAB为去污剂的Tris-HCl-EDTA-NaCl缓冲体系，溶解粗RNA，并添加异硫氰酸胍。其中的硼酸可以与棉花组织中富含的酚类化合物以氢键形成复合物，抑制酚类物质的氧化及其与RNA的结合；CTAB、异硫氰酸胍可以使蛋白质迅速变性，有利于防止RNA的降解，保持其完整性，同时，该缓冲系统可以有效地去除多糖，使RNA与多糖能有效分离，大大提高了RNA的纯度。 

由于棉花是最难提取RNA的代表性植物之一，本方法在棉花上取得满意效果之后，我们用该方法又分别尝试从拟南芥、水稻、松树、香蕉(果皮、果肉)、雪松、冬青等植物中提取RNA，成功率达到100％，OD260/OD280比值稳定在2.0左右。说明该方法适用范围广。 

三、发明内容

技术问题 

本发明的目的在于提供一种广谱、高效提取植物RNA的方法和试剂盒。 

技术方案 

本发明总结出缓冲系统是决定植物RNA纯度、产率、品质的最主要技术因素，发明了串联使用两种缓冲系统高效提取和分离植物组织RNA的技术方法。在第二种缓冲液中添加1mol/L异硫氰酸胍，有效抑制了RNase活性，有效去除多糖物质，大大提高了RNA的完整性和纯度。 

一种广谱、高效从植物中提取RNA的试剂盒，包括： 

(1)提取缓冲溶液I，即硼砂-十二烷基磺酸钠SDS提取缓冲液：质量体积百分比浓度为2％的SDS，0.0125mol/L硼砂，用硼酸调节pH到8.5，加入焦炭酸二乙酯DEPC使浓度达到0.1％体积百分比，高温高压灭菌；