[发明专利]一种广谱高效提取植物RNA的试剂盒

权利要求书

1.一种广谱、高效从植物中提取RNA的试剂盒，包括：

(1)提取缓冲溶液I，即硼砂-十二烷基磺酸钠SDS提取缓冲液：质量体积百分比浓度为2％的SDS，0.0125mol/L硼砂，用硼酸调节pH到8.5，加入焦炭酸二乙酯DEPC使浓度达到0.1％体积百分比，高温高压灭菌；

(2)提取缓冲溶液II，即十六烷基三甲基溴化铵CTAB提取缓冲液：100mol/L pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷Tris-盐酸HCl，20mmol/L pH为8.0的乙二胺四乙酸钠EDTA-Na₂，质量体积百分比浓度为2％的CTAB，1.4mol/L氯化钠NaCl，质量体积百分比浓度为2％的聚乙烯吡咯烷酮PVP，体积百分比浓度为1％的β-巯基乙醇，1mol/L异硫氰酸胍；

(3)3mol/L pH为5.2的醋酸钠NaAc溶液：4.801g NaAc·3H₂O或3.566g NaAc·H₂O溶于8mL水，用冰醋酸调pH至5.2，加入10μL DEPC，定容至10mL，高温高压灭菌；

(4)8mol/L氯化锂LiCl：33.91g LiCl溶于100mL水，加入100μL DEPC，高温高压灭菌；

(5)异丙醇：纯度100％；

(6)DEPC水或称无RNase水：体积百分比浓度0.1％DPEC的双蒸水溶液，高温高压灭菌。

2.权利要求1所述试剂盒用于从植物中提取RNA的方法，其特征在于：以硼酸缓冲液为缓冲体系首先有效分离和富集植物组织RNA，再以Tris-HCl-EDTA-NaCl为缓冲液、CTAB为去污剂并加入1mol/L异硫氰酸胍抑制RNase活性，提取纯品RNA。

3.根据权利要求2所述一种从植物中提取RNA的方法，其特征在于：

(1)向10mL离心管中加入3.0mL提取缓冲溶液I、0.25mL β-巯基乙醇、2.0mL pH为8.0的Tris饱和酚，1.5mL体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇；

(2)取0.1g新鲜植物组织，加入0.1g交联聚乙烯吡咯烷酮PVPP，在液氮中充分研磨成粉状，将冻粉迅速转入上述10mL离心管中，旋涡剧烈震荡3min，冰上放置5min；

(3)4℃，10,000g离心15min；

(4)将上清液转至离心管中，加入等体积预冷异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，-20℃静置1～2h，4℃，10,000g离心20min，弃上清；

(5)沉淀中加3mL提取缓冲溶液II，65℃水浴15min；中途翻转混匀；

(6)加等体积氯仿充分混匀，冰浴静置10min；

(7)4℃，10,000g离心20min；

(8)上清加1/3体积8mol/l LiCl混匀，-70℃，30min或-20℃，1-2h冰浴；

(9)4℃，10,000g离心20min，弃上清，沉淀即为粗RNA，用70％体积百分比的乙醇洗涤两次后溶解于50μL DEPC水；

(10)加入10U无RNase活性的DNase，和25U RNase抑制剂(RNasin Plus，Promega，N2611)，DEPC水补足体积到100μL，消化其中的DNA；

(11)直接补加：500μL DEPC水和600μL体积比为1∶1的Tris-酚∶氯仿，4℃9,600g离心20min，上清转移至另一新的2mL管中；

(12)加入等体积的体积比24∶1的氯仿∶异戊醇，抽提一次；

(13)上清液转移到新管中，加入1/10体积的3mol/L pH5.2的NaAc-HAc，2.5倍体积无水乙醇，-70℃冰浴沉淀1.5h；

(14)4℃9,600g离心20min，沉淀即为纯化的RNA。