[发明专利]白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程，具体涉及一种可在细胞内稳定且高效表达的白细胞介素6（interleukin-6, IL-6）基因重组逆转录病毒载体的构建方法。

背景技术

白细胞介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。由于最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，所以由此得名。白细胞介素interleukin缩写为IL。白细胞介素6（以下缩写为IL-6）可由多种细胞合成，包括活化的T淋巴细胞和B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、上皮细胞以及成纤维细胞等。人类IL-6基因位于第7号染色体上；IL-6分子量在21～30kd之间，其差异是由于肽链的糖基化和磷酸程度不同所致。IL-6是以单体形式存在，主要功能为刺激细胞成长、促进细胞分化，对维持机体生理平衡具有重要作用。

IL-6作用的靶细胞很多，包括巨噬细胞、肝细胞、静止的T淋巴细胞、活化的B淋巴细胞和浆细胞等；其生物效应是：

① 促进T 淋巴细胞表面IL-2R的表达，增强IL-1（即白细胞介素1）和TNF（肿瘤坏死因子）对T辅助细胞的有丝分裂作用；

② 作为肝细胞刺激因子，在感染或外伤引起的急性炎症反应中，诱导急性期反应蛋白的合成，其中以淀粉状蛋白a和c-反应蛋白增加尤为明显；

③ 促进B淋巴细胞增殖、分化并产生抗体；多发性骨髓瘤的恶变B淋巴细胞既能产生IL-6，又能对IL-6发生应答，提示IL-6可能作为这些细胞的自分泌性生长因子；

④ IL-6还能有效地促进TNF和IL-1诱导的恶病质；促进糖皮质激素合成；刺激破骨细胞活性和角质细胞生长；还能促进骨髓造血的功能。

IL-6不能刺激相应细胞分泌其它细胞因子，在生理浓度下对免疫细胞的自分泌作用亦比较弱，其主要免疫学功能是加强其它细胞因子的效果。

逆转录病毒是RNA病毒，它有三个结构蛋白基因：gag-编码病毒衣壳、基质等结构蛋白的基因；pol-编码逆转录酶(p66/p51)、蛋白水解酶和整合酶；env-编码gpl20和gp41两种包膜糖蛋白。在逆转录酶的作用下可使RNA转录为cDNA，整合到宿主细胞基因组中，并随着宿主细胞中的DNA复制、转录和翻译等蛋白酶作用下扩增。近年来随着基因工程的不断发展，已设计构建成一些缺陷型病毒，使逆转录病毒成为有用的基因载体，特别是动物基因克隆载体。其最重要的一点是它可以有效的整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。病毒基因组以转座的方式整合，其基因组不会发生重排，因此所携带的外源基因也不会改变。此外，逆转录病毒载体的寄主范围相当广泛，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等，其中有的还能够在人体细胞中生长；而且逆转录病毒载体的感染效率高，所感染的细胞不会产生病变导致寄主细胞的死亡。目前市场上销售的多为纯化的重组IL-6细胞因子，价格非常昂贵，若用于动物体内，则以每公斤微克量来计算，一只成年大鼠体内注射IL-6平均需要花上百元，因此，有必要构建重组质粒来满足科学研究的不断需求。

发明内容

本发明的目的是提供白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法，该方法对设备要求不高，逆转录病毒载体的理化性质稳定，在制备、储存和应用过程中简单易行，适合推广应用；得到的白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体能够感染多种类型的细胞，既可以应用于体外培养的细胞，也可以用于整体实验动物，应用范围广，感染效率高；而且价格较低。

本发明所述的白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法，其步骤如下：

（1）白细胞介素6（IL-6）基因片段的扩增；

通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法，以大鼠骨髓间充质干细胞cDNA为模板，分别在上游引物的5’端和下游引物3’端设计HinDⅢ和BamHⅠ限制性内切酶酶切位点（斜体下划线为酶切位点），即  

上游引物5’-ATC AAGCTT ACCACCATGGGC ATGAAGTTTCTCTCCGC-3’

上游引物5’-CGT GGATCC GGTTTGCCGAGTAGACCTCATAGTGAC-3’

touch down PCR扩增获得IL6目的基因片段rIL6，其序列为