[发明专利]白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法

权利要求书

1.白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法，其步骤如下：

（1）白细胞介素6（IL-6）基因片段的扩增；

通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法，以大鼠骨髓间充质干细胞cDNA为模板，分别在上游引物的5’端和下游引物3’端设计HinDⅢ和BamHⅠ限制性内切酶酶切位点（斜体下划线为酶切位点），即 

上游引物5’- ATCAAGCTT ACCACCATGGGC ATGAAGTTTCTCTCCGC- 3’

上游引物5’ -CGT GGATCC GGTTTGCCGAGTAGACCTCATAGTGAC-3’

touch down PCR扩增获得IL-6目的基因片段rIL6；

（2）重组pSEB-rIL6逆转录病毒质粒的构建和鉴定；

采用pSEB逆转录病毒载体系统, 该系统具有组蛋白标签、hEFH启动子及开放读码框（ORP）；hEFH启动子可有效启动插入ORP中靶基因的高效表达，同时3组6个连续组蛋白可以作为检测标签，反映ORP中插入靶基因的表达水平；将步骤（1）中所获得的基因片段rIL6的PCR产物及逆转录病毒载体pSEB-3H分别经HinDⅢ和BamHⅠ双酶切，连接转化进入DH2a感受态菌中，通过氨苄青霉素筛选单克隆，获得具有IL-6重组的逆转录病毒质粒pSEB-IL6，并进行PCR、双酶切及序列鉴定；

（3）重组pSEB-rIL6逆转录病毒质粒在真核细胞中表达功能的测定；

针对步骤（2）所获得正确序列的逆转录病毒pSEB-IL6质粒在真核细胞中的表达应用,利用脂质体转染系统，将步骤（2）中所获得的逆转录病毒pSEB-IL6质粒分别转染到大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞和人胚肾细胞HEK293中，mRNA水平和蛋白水平测定IL-6的表达水平。