[发明专利]一种能够筛选并富集实体肿瘤干细胞的新方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养制造领域，更具体地，涉及一种从实体肿瘤细胞中筛选、富集、培养和扩增相应肿瘤干细胞亚群的技术，作为实体瘤治疗药物筛选和生物治疗、基因治疗的筛选、体外评价模型方法和实验材料。

背景技术

实体瘤是肿瘤疾病中的主要种类，是威胁人类健康的一种重要疾病。关于实体瘤的起源，目前存在着两种不同的模型。一种模型认为肿瘤是一种多基因功能异常的疾病。细胞/组织在病变过程中，随着致癌基因以及表观遗传基因突变的增加，细胞/组织逐渐形成癌前病变，癌变细胞/组织以及恶性癌变细胞/组织。另一类模型认为肿瘤是由肿瘤干细胞增殖分化出来的。肿瘤干细胞在肿瘤细胞/组织中的含量非常少，但却具有类似于胚胎干细胞的自我更新的能力。肿瘤干细胞是干细胞(胚胎干细胞以及成体干细胞)发生基因以及表观遗传基因突变后形成的具有恶性增殖特征的一类干细胞，是肿瘤细胞化、放疗失败的重要因素。肿瘤干细胞最初在白血病患者的肿瘤细胞中被分离出来，发现该肿瘤干细胞具有表面特征抗原CD96。随后在实体瘤中也发现并鉴定了肿瘤干细胞的存在。如在乳腺癌中存在着一种ABCG2基因高表达的细胞亚群，具有肿瘤干细胞的特征。另外还发现ALDH1，CD24，CD44，CD90，CD133也是用来鉴定肿瘤干细胞常用的一些生物标志物分子。肿瘤干细胞的分离主要是从新鲜的肿瘤组织中分离。分离方法主要是通过流式细胞分选技术以及免疫磁珠的方法进行(1-3)。采用流式细胞分选方法获得的肿瘤干细胞纯度较高，可达95％以上，但分选过程会对细胞有较大的损伤，磁珠分选方法虽然条件比较温和，但是分选的干细胞纯度较低，达到80％就是一个比较好的分离结果了。上述两种方法面临的一个共同问题就是分离干细胞需要使用高质量的单克隆抗体，分离成本非常高。另外分离出的肿瘤干细胞如何扩增而不失去或改变其干细胞的特征仍然是一个当前没有解决的一个技术瓶径(3)，是制约肿瘤干细胞研究和发展新的肿瘤治疗技术的技术障碍。因此目前研究和产品研发上迫切需要由实体肿瘤细胞(株)直接进行肿瘤干细胞筛选、培养、扩增的简便方法。

发明内容

本发明主要涉及到一种从实体肿瘤细胞株中分选、富集、培养和扩增肿瘤干细胞的新方法。用该方法获得的实体肿瘤干细胞具有肿瘤干细胞的特征基因、干细胞表面标志抗原的高表达。用该方法获得的肿瘤干细胞是筛选新型抗肿瘤治疗药物的体外模型。

本发明的核心内容有以下四个方面。

第一方面，本发明提供了一种能快速培养和富集实体肿瘤干细胞的新方法。在实体肿瘤细胞的培养中，以DMEM/F12，胚胎干细胞培养基如HEScGRO^TM为培养基主要组分的改性干细胞培养基进行肿瘤细胞的贴壁培养，肿瘤干细胞可以逐渐形成集落，而非肿瘤干细胞逐渐凋亡。所形成的集落具有肿瘤干细胞的特征。

本领域的技术人员应该理解，本发明所述的DMEM/F12，胚胎干细胞培养基是肿瘤干细胞集落培养的主要成分，其中胚胎干细胞培养基不局限于HEScGRO^TM，还包括利用胚胎干细胞培养基为基础，添加某些细胞增殖相关的成分，如细胞因子的培养基。

第二方面，本发明提供了能有效筛选肿瘤干细胞的干细胞培养改性剂。该改性加剂通过抑制GSK信号通路和酪氨酸激酶抑制剂达到有效抑制干细胞分化，提高血液肿瘤干细胞筛选的效率。

第三方面，本发明提供了本发明所述的培养基的用途，其可以用于制备实体肿瘤细胞的干细胞。这些肿瘤细胞可以是已经建株的血液肿瘤细胞株，也可以是原代肿瘤细胞。

第四方面，本发明提供了包含本发明所述的核心培养基的实体肿瘤干细胞培养试剂盒。

第五方面，本发明提供了包括使用本发明所述的实体肿瘤干细胞用于肿瘤治疗的细胞模型。

以下将通过实施例对本发明作进一步的阐述，但实施例并不限制本发明的保护范围。本领域的技术人员完全可以根据本发明的构思和所公开的技术方案，进行不背离本发明的精神和范围的修改和变动，这也在本发明的保护范围之内。

附图说明

图1人乳腺癌细胞MCF-7在含有本发明阐述的改性的DMEM/F12培养基中形成的克隆集落。

图2人前列腺癌细胞Du-145在含有本发明阐述的改性的胚胎干细胞培养基中形成的克隆集落。

图3人前列腺癌细胞Du-145的干细胞克隆的磷酸酶染色性质

图4人乳腺癌细胞Du-145经干细胞克隆培养后相关的干细胞特征基因的表达

具体实施方式