[发明专利]一种鱼皮胶原蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于鱼皮胶原蛋白加工领域，具体涉及一种可以作为鱼类细胞培养载体的鱼皮胶原蛋白制备方法。

背景技术

胶原蛋白是一种重要的功能性蛋白质，胶原蛋白含有一种独特的氨基酸-羟脯氨酸(Hyp)，胶原蛋白与细胞增生、分化、运动、免疫、关节润滑、伤口愈合等密切相关。由于胶原蛋白的特殊功能，已被广泛应用于医药、食品、日用化工、生物合成等工业领域，如医用胶囊、外科手术材料、食用明胶、照相明胶、化妆品等。

目前生产的胶原蛋白的原料主要是猪、牛等陆生哺乳动物的皮、骨和肌腱，因近年来随着导致疯牛病、口蹄疫等流行病的发生，使得从陆生动物皮、骨中提取胶原蛋白的危险性增大。欧、美、日本等国家相继出台了不少法规，限制从牛等哺乳动物皮、骨中提取物用于食品、医药等对人体直接影响的产品中。因而，从水生动物鱼皮中提取安全、卫生、无害的胶原蛋白已成为当前国内外研发的一个热门课题。我国养殖鱼类产量多年来一直位居世界第一，同时，随着罗非鱼、斑点叉尾鮰鱼片加工业的发展，具有大量的鱼皮资源，从这些废弃物中提取胶原蛋白并加以多用途利用，具有较大的开发前景。

动物细胞培养需要胶原蛋白作为支持载体，常规的胶原蛋白主要为牛皮胶原和鼠尾胶原I型胶原蛋白，主要是为了可改善培养瓶、或培养板表面性状，有利于细胞贴壁生长。在我们的实验中发现，使用牛皮胶原蛋白或鼠尾胶原蛋白作为支持载体，用于草鱼肠道原代上皮细胞、肝脏原代细胞培养时细胞贴壁速度慢，细胞生长不是很理想。

现有技术中，利用鱼皮提取胶原蛋白的方法有以下几种：

1、专利号为02111683.0的中国发明专利公开了一种以深海鱼皮为原料的生物相容性好的胶原蛋白及其制备方法：通过碱溶液处理鱼皮，再利用限制性酶解方法处理上述鱼皮，净化酶解上清液即得可降解生物相容性的鱼皮胶原蛋白；该技术方案中，碱性条件容易造成肽键水解，不易获得完整的大分子胶原蛋白，而且酶的使用使得成本提高，并且，该技术方案中胶原蛋白的得率也不高，为5％～8％质量百分数，得率不高。

2、专利号为200710024384.0的中国发明专利公开了一种淡水鱼皮胶原蛋白的制备方法，属于水产加工技术领域：将鱼皮洗净、沥干、剪碎后；首先用含有0.005％-2％(V/V)双氧水的0.001-0.2M的碱液浸泡3-48H；高速搅拌后，再用有机试剂清洗、浸泡；然后用含有0.01％-2％(M/V)胃蛋白酶的PH在1.0-5.0的酸液提取12-64H，所得体系用30-100MM的膜过滤后，再用1-30MM的膜过滤；最后向滤液中加入5M NaCl溶液至0.8-2.0M，离心所得沉淀用0.001-0.1M乙酸溶解，蒸馏水透析，冷冻干燥，即可得到洁白无腥味的胶原蛋白固体；该技术方案中，酶的使用使得成本提高。

3、专利号为200510047408.5的中国发明专利公开了一种酸溶性鱼皮胶原蛋白，包括原料处理、提取、盐析、纯化透析干燥步骤，具体包括：

(1)原料处理：海鱼皮为原料，切碎；

(2)提取：NaCl溶液浸泡去杂质、乙醇丙酮脱脂的处理，进而用柠檬酸和醋酸的混合液浸泡提取后离心分离得酸溶性鱼皮胶原溶液；

(3)盐析：再经NaCl固体盐析得酸溶性鱼皮胶原蛋白沉淀；

(4)纯化透析干燥：最后将酸溶性鱼皮胶原蛋白沉淀溶解于醋酸溶液中，而后在Na₂HPO₄(pH8.6)中透析，或经分子量大于6万的醋酸纤维中空纤维膜进行超滤处理，透析或超滤得到的固体真空冷冻干燥即可得到产品。产品洁白，无腥味，冷冻干燥后呈海绵状。胶原蛋白制品纯度达≥97％。胶原蛋白中含有丰富的甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸，其水解产物中还有生理活性肽，胶原蛋白分子量大于60000，含有3条异种α链，即α1(I)、α2(I)和α3(I)，该方案中胶原蛋白的得率为12％～14％质量百分数，得率不高。

4、专利号为200610036860.6的中国发明公开了一种提取胶原的方法及用胶原制备胶原蛋白的方法，以罗非鱼皮为原料，将鱼皮剪碎后加入正己烷，脱脂后用0.05～0.2M的NaOH溶液除杂蛋白，然后用醋酸溶液提取胶原蛋白，经浓缩、冷冻干燥得到胶原。

并且，上述4种方案并没有指出所得鱼皮胶原蛋白作为鱼类细胞培养载体具有意想不到的效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种鱼皮胶原蛋白的制备方法，在保持所得鱼皮胶原蛋白的生物特性、纯度的基础上，提高得率，并且应用所得鱼皮胶原蛋白作为鱼类细胞培养载体。